三系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及育种技术领域，特别设及一种Ξ系杂交小麦种子纯度分子标记及其引 物对和应用。
【背景技术】
[0002] 利用小麦杂种优势是提高小麦单产的有效途径。目前，小麦利用杂种优势的主要 途径有："Ξ系法"、"两系法"和"化学杀雄法"。
[0003] Ξ系法是指将不育系、保持系和恢复系进行Ξ系配套，不育系为母本，保持系为父 本，相间种植，不育系所结种子下代仍为雄性不育，不育系循环繁殖或用W配制杂交种；W 不育系为母本，恢复系为父本，相间种植，通过恢复系授给不育系花粉，不育系植株上生产 的种子即为杂交种。
[0004] 两系法主要是利用光溫敏雄性不育系和相应恢复系实现二系配套。光溫敏雄性不 育受隐性主基因控制，其育性的表达受外界溫光条件的影响。在敏感期，当环境溫度在不育 临界溫度范围时，表现为完全不育，运时不育系可用来与恢复系制种；当环境溫度在可育临 界溫度范围时，不育系又恢复正常可育，自交结实繁殖。在杂交制种中，将溫光敏不育系种 子和恢复系相间种植，来生产小麦杂交种。
[0005] 化学杀雄法是指将强优势组合的亲本相间种植，在小麦抽穗一散粉关键时期，对 母本喷施化学药剂，杀死母本的花粉，导致母本不育，通过父本授给母本花粉，使母本异交 结实，生产小麦杂交种。
[0006] 在上述Ξ种小麦杂交种生产过程中，杂交种的纯度至关重要。因为种子的纯度将 决定生产出的杂交种子能否在生产上应用，同时种子纯度还影响杂交种的田间长势长相和 杂种优势表现。Ξ系杂交小麦不育系亲本种子繁殖或杂交种种子生产，采用不育系母本与 保持系父本或不育系母本与恢复系父本按不同行比种植。收获时，父、母本必须分别收获， 即先割除父本，后收获不育系或杂交种，尽可能地降低种子的机械混杂。由于小麦是自花授 粉作物，父本保持系或恢复系可W自我繁殖，加上播种质量、栽培措施、收获环节复杂等影 响，在收获过程中，会造成少量父本割除不及时或不完全，难免会有保持系或恢复系种子混 入，从种子形态上很难鉴别出混杂的种子，导致杂交种子的机械混杂，会降低杂交种的纯 度。
[0007] 目前我国采用的小麦种子纯度检测方法分为组织化学鉴定法、幼苗鉴定法、田间 鉴定法和巧粒醇溶蛋白鉴定法(王立新等，2009)。但是运些方法都有一定的缺陷或局限性。 组织化学法是凭借苯酪和氨氧化钢与种子各组织发生的颜色反应，根据种子间颖果和种皮 着色差异区别杂株的种子，而小麦品种之间种子组织对染料的反应差异不大，很难依此鉴 定种子纯度。幼苗鉴定法是根据幼苗叶銷颜色辨别杂株，而幼苗叶銷颜色只有紫色和绿色， 如果杂株与测试品种幼苗叶銷颜色一致，则无法辨别杂株。田间鉴定法是根据国标《植物新 品种特异性、一致性和稳定性测试指南普通小麦6(GB/T 19557.2-2004)》，对测试品种全生 育期25~56个重要表型和农艺性状进行一致性测试，需要一定面积的田间试验，试验周期 较长。运样势必费时费力，增加成本。又因有些农艺性状为数量性状，株间差异往往为连续 数据，而且容易受环境因素影响，降低了测试结果的准确性。巧粒醇溶蛋白鉴种子定法是依 靠凝胶电泳技术展现品种间的醇溶蛋白亚基带型的差异而判断种子纯度。但因醇溶蛋白的 所有组分在一块凝胶中电泳分离，没有足够的空间展示所有组分，使该技术灵敏度大打折 扣。
【发明内容】
[000引有鉴于此，本发明实施例提供一种Ξ系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对和 应用，主要目的是准确鉴定Ξ系杂交小麦种子纯度。
[0009] 为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
[0010] -方面，本发明实施例提供了一种Ξ系杂交小麦种子纯度分子标记，所述分子标 记为SSR分子标记，所述分子标记为位于2A染色体上的Wmc474或位于1B染色体上的Barc8。
[0011] 另一方面，本发明实施例提供了一种Ξ系杂交小麦种子纯度分子标记的引物对， 其中
[0012] 位于2A染色体上的Wmc474的引物对的序列如下：
[0013] Xwmc47 化：ATGCTATTAAACTAGCATGTGTCG，
[0014] Xwmc474R：AGTGGAAACATCATTCCTGGTA；
[001引位于1B染色体上的Barc8的引物对的序列如下：
[0016] Xbarc化：GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGAA，
[0017] XbarcSR:GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA。
[0018] 另一方面，本发明实施例提供了一种Ξ系杂交小麦种子纯度分子标记在AL型Ξ系 杂交小麦种子纯度检测中的应用。
[0019] 作为优选，所述应用包括如下步骤：
[0020] 将Ξ系杂交小麦种子与非杂交种子按不同的设计比例混合形成多个试验组，待发 苗后提取DNA;
[0021] 用所述SSR分子标记对应的引物对其幼苗DAN进行PCR扩增，聚丙締酷胺凝胶电泳 染色检测，分别统计各试验组的杂交种和非杂交种子的检测数量；
[0022] 将统计出的检测值与设计的理论值作相关性分析和回归分析得到小麦杂交种纯 度计算值与检测值的方程；
[0023] 将待测Ξ系杂交小麦种子抽样发苗、提取叶片DNA，然后利用所述SSR分子标记对 应的引物进行检测，将检测值代入上述方程，计算得到待测小麦杂交种纯度。
[0024] 作为优选，所述Ξ系杂交小麦种子分别与恢复系种子和保持系种子按不同的设计 比例混合形成多个试验组。
[0025] 作为优选，所述Ξ系杂交小麦种子与恢复系种子混合时，
[00%] W位于2A染色体上的Wmc474的引物对其幼苗DNA进行扩增，建立的混入恢复系种 子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下:y = 4.rw+0.7875x，其中X为混入的恢复 系种子的检测值，y为混入的恢复系种子的计算值；
[0027] W位于1B染色体上的Barc8的引物对其幼苗DNA进行扩增，建立的混入恢复系种子 的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下:y = -〇. 145化0.9314X，其中X为混入的恢复 系种子的检测值，y为混入的恢复系种子的计算值；
[00%]所述Ξ系杂交小麦种与保持系混合时，
[0029] W位于2A染色体上的Wmc474的引物对其幼苗DNA进行扩增，建立的混入保持系种 子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下:y = 〇. 2109+0.6797X，其中X为混入的保 持系种子的检测值，y为混入的保持系种子的计算值；
[0030] W位于1B染色体上的Barc8的引物对其幼苗DNA进行扩增，建立的混入保持系种子 的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下:y = 〇. 4083+0.7583X，其中X为混入的保持 系种子的检测值，y为混入的保持系种子的计算值。
[0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0032] 本发明根据AL型（普通小麦细胞质雄性不育）杂种小麦品种与其不育系和恢复系 亲本在DNA水平上的多样性差异，利用小麦2A染色体上的分子标记Wmc474和1B染色体上的 分子标记barc8与育性恢复基因连锁，对杂交种内混杂不同比例的亲本种子可W有效区分， 并在此基础上建立了一种AL型杂交小麦种子纯度分子标记检测方法，该方法解决了需要田 间种植进行杂种纯度鉴定费时费力的问题。确保小麦杂交种纯度分子标记检测的实用性， 必将对种子企业和农民推广小麦杂交种产生积极作用。
【附图说明】
[0033]
[0034] 图1至图6为本发明实施例中Ξ系杂交小麦种子纯度检测图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。在 下述说明中，不同的"一实施例"或"实施例"指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施 例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
[0036] 本发明实施例提供了一种Ξ系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对，该分子标 记为SSR分子标记，本发明实施提供的分子标记为位于2A染色体上的Wmc474或位于1B染色 体上的Bar c8。
[0037] 上述分子标记的引物对具体如下，其中
[003引位于2A染色体上的Wmc474的引物对的序列为：
[0039] Xwmc47 化：ATGCTATTAAACTAGCATGTGTCG，
[0040] Xwmc474R：AGTGGAAACATCATTCCTGGTA；
[0041 ] 位于1B染色体上的Barc8的引物对的序列为：
[004。 Xbar C化：GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGAA，
[0043] Xbarc8R:GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA。
[0044] 本发明实施例在上述分子标记的基础上，提供了一种Ξ系杂交小麦种子纯度分子 标记检测方法，将上述的分子标记应用于AL型Ξ系杂交小麦种子纯度检测中。
[0045] 本发明实施例根据AL型(普通小麦细胞质雄性不育）杂种小麦品种与其不育系和 恢复系亲本在DNA水平上的多样性差异，利用小麦2A染色体上的SSR分子标记Wmc474和1B染 色体上的分子标记barc8与育性恢复基因连锁，对杂交种中混杂不同比例的非杂交种种子 进行有效区分。
[0046] 作为上述实施例优选，本发明实施例的Ξ系杂交小麦种子纯度分子标记在AL型Ξ 系杂交小麦种子纯度检测中的应用具体包括如下步骤：
[0047] 将Ξ系杂交小麦种子与非杂交种子按不同的设计比例混合形成多个试验组，待发 苗后提取DNA;
[0048] 用上述的SSR分子标记对应的引物对其幼苗DNA进行PCR扩增，聚丙締酷胺凝胶电 泳染色检测，分别统计各试验组的杂交种子和非杂交种子的检测数量；
[0049] 将统计出的检测值与设计的理论值作相关性分析和回归分析得到小麦杂交种纯 度计算方程；
[0050] 将待测Ξ系杂交小麦种子抽样发苗、提取叶片DNA，然后利用所述SSR分子标记对 应的引物进行检测，将检测值代入上述方程，最终得到待测小麦杂交种子纯度。
[0051] 小麦杂交种是由母本和父本杂交获得的，因此，在基因型上同时具有母本带型和 父本带型，属杂合带。通过PCR扩增和聚丙締酷胺凝胶电泳染色检测后，杂交种在凝胶上显 示杂合带型，与父本、母本均可从凝胶带型上区别开来。PCR扩增后，利用聚丙締酷胺凝胶电