干扰PRKCE基因表达的siRNA序列及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体设及干扰P服CE基因表达的siRNA序列及其抑制卵 巢癌迁移和侵润的用途。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，在所有妇科肿瘤当中其发病率 仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第Ξ位。其死亡率占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命 造成严重威胁。由于卵巢深居盆腔，早期症状很不明显，患者难W察觉，同时又缺乏有效的 筛检方法，所W大多数患者确诊时已为晚期。即使经过有效的治疗，仍有近75%患者在病情 缓解后复发，严重影响了女性的生命健康。大量研究发现卵巢癌的高发病率和高死亡率的 主要原因是恶性肿瘤的侵润和转移。癌细胞的迁移和侵润是两个不同的病理过程，侵润是 迁移的前提。肿瘤细胞的侵袭与转移是肿瘤发生和发展的重要阶段。因此找到抑制癌细胞 迁移与侵润的有效方法，有效地杀伤癌细胞是提高患者生存率的关键。
[0003] P服CE(P;rotein Kinase C,epsilon)是一个蛋白编码基因。PKC(P;rotein Kinase C)即蛋白激酶C，是存在于哺乳动物细胞内脂质依赖性丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是细胞内 重要的信号转导分子，可被巧离子和第二信使甘油二醋激活。PKC是调控细胞功能的重要分 子，能够中介多种神经体液因子。而P服CE已被证明是参与在许多不同的细胞功能，如神经 元通道的激活，细胞调亡，屯、肌缺血，热休克反应，W及膜岛素胞吐作用。小鼠基因敲除的研 究表明，运种激酶对脂多糖化PS)是重要的介导激活的巨隧细胞信号也可W控制焦虑样行 为发挥作用。总之，P服CE就是憐酸化使其下游的信号分子中丝苏氨酸残基憐酸化，被P服CE 憐酸化后的信号分子继续把信号传递到细胞内的不同祀区，从而产生特定的生物学效应。 在所有的PKC家族中，P服CE是唯一一种具有原癌基因功能的蛋白激酶，通过Ras/Raf/E服及 Akt途径，P服CE可W调节细胞的增生及调亡。P服CE-siRNA影响细胞增殖、侵袭、转移等一系 列复杂功能变化及相关蛋白表达变化的分子生物学机制可能为:P服CE-siRNA降低ME180细 胞中的PRKCE蛋白表达后，MAPK信号通路的转录活性明显降低，可能进而选择性影响了 cyclinDl蛋白和MMP-2蛋白的表达，从而使细胞的增殖、侵袭和转移能力受到明显影响。
[0004] 针对P服CE的研究逐渐增多，P服CE是PKC家族中与肿瘤的发生发展密切相关的重 要亚型之一，P服CE表达水平与乳腺癌、膜腺癌、肺癌等多种肿瘤相关。一般认为其可能通过 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、憐酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)等信号通路来影响肿 瘤细胞的迁移和侵润等生物学过程，其有望成为包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤的基因治 疗祀点。但是目前还没有关于利用SiRNA序列来干扰PRKCE基因的表达达到卵巢癌细胞迁移 侵润效果的专利发表。
[0005] 本发明设及了两对针对P服CE基因的S i RNA序列，它们能够有效的干扰PRKCE基因 的表达，从而抑制卵巢癌细胞的迁移侵润。因此，本发明设及的两对有效的SiRNA序列可能 在卵巢癌治疗方面发挥治疗作用，而且迄今为止尚未见有国内外的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是通过沉默P服CE基因验证其对卵巢癌细胞迁移侵润的影响，判断 沉默P服CE基因的siRNA序列的特异性和P服CE基因对卵巢癌细胞迁移侵润的影响；提供两 种干扰PRKCE基因表达的siRNA序列及其抑制卵巢癌细胞迁移和侵润的用途。
[0007] 干扰PRKCE基因表达的SiRNA序列，是该序列为下列两对序列中的任意一种或两 种：
[000引 巧1:5^-GAACACUACCAUGGUCGGGUU-3/ /5^-CCCGACCAUGGUAGUGUUCUU-3,
[0009]巧2:5' -ACACAUGAAUAUGAUGGGCUU-3' /5' -GCCCAUCAUAUUCAUGUGUUU-3,
[0010]上述干扰P服CE基因表达的SiRNA序列用途，所述的小分子干扰RNA可W沉默卵巢 癌细胞中的PRKCE基因，从而显著抑制卵巢癌细胞的迁移和侵润能力。
[0011] 上述干扰P服CE基因表达的SiRNA序列用途，可W制备抑制卵巢癌细胞转移药物。
[0012] 本发明的有益效果为:本发明针对P服CE基因设计了一系列SiRNA序列，并筛选出 两对siRNA序列可W抑制P服CE基因的表达。通过脂质体将合成的siRNA转入A2780和SK0V3 卵巢癌细胞中，并设立对照组。用实时定量PCR验证SiRNA对P服CE基因表达的抑制作用，通 过细胞划痕实验，迁移和侵润实验检验SiRNA对A2780和SK0V3细胞迁移和侵润能力的影响。 结果表明：细胞划痕和迁移实验证实，两种SiRNA都能抑制A2780、SK0V3细胞的迁移;细胞侵 润实验证实，两种SiRNA都能抑制SK0V3细胞的侵润。本发明提供的两种SiRNA序列在未来卵 巢癌治疗中具有非常大的潜在价值。
【附图说明】
[0013] 图1.对照组和试验组中P服CE基因的表达水平，与对照组相比，试验组中阳1和阳2 显示出显著抑制P服CE基因的表达(P<0.01)。
[0014] 图2.A2780细胞各组经过划痕实验的处理后，分别在化，24h，48h，7化，9化W及 12化运些时间点采集图片，对比分析检测SiRNA沉默P服CE基因对卵巢癌细胞A2780的影响。 [001引图3.A2780细胞各组经过划痕实验的处理后，分别在化，2祉，4811，7化，9化^及 12化运些时间点，将各组的迁移距离进行统计，经过Ξ次独立的实验后统计汇总分析得到 沉默PRKCE基因对A2780细胞划痕实验迁移速率的影响折线图。
[0016] 图4. SK0V3细胞各组经过划痕实验的处理后，分别在化，6h，12h，24h，3化W及36h 运些时间点采集图片，对比分析检测SiRNA沉默P服CE基因对卵巢癌细胞SKOV-3的影响。
[0017] 图5. SK0V3细胞各组经过划痕实验的处理后，分别在化，6h，12h，24h，3化W及36h 运些时间点，将各组的迁移距离进行统计，经过Ξ次独立的试验后统计汇总分析得到沉默 Ρ服CE基因对SK0V3细胞划痕实验迁移速率的影响折线图。
[0018] 图6.对于卵巢癌Α2780细胞，将化answell小室下室进行拍照，经过Ξ次独立实验 后，选取最好的实验结果进行对比分析，结果提示:可W明显看出沉默P服CE基因对卵巢癌 细胞A2780的迁移抑制作用显著。
[0019] 图7.对于卵巢癌A2780细胞，将化answell小室下室进行计数，经过Ξ次独立实验 后，我们将对照组及试验组化ipo、阳1、PE2)迁移的细胞数进行百分比对比分析，其差距具 有统计学意义(P<〇.〇〇l)。结果提示:可W明显得出沉默P服CE基因对卵巢癌细胞A2780的迁 移抑制作用显著，其差距具有统计学意义(p<0.001)。
[0020] 图8.对于卵巢癌SK0V3细胞，将化answell小室下室进行拍照，经过Ξ次独立实验 后，选取最好的实验结果进行对比分析，结果提示:可W明显看出沉默P服CE基因对卵巢癌 细胞A2780的迁移抑制作用显著。
[0021] 图9.对于卵巢癌SK0V3细胞，将化answell小室下室进行计数，经过Ξ次独立实验 后，我们将对照组及试验组化ipo、阳1、阳2)迁移的细胞数进行百分比对比分析。结果提示： 可W明显得出沉默P服CE基因对卵巢癌细胞A2780的迁移抑制作用显著，其差距具有统计学 意义(P<0.001)。
[00剖图10.对于卵巢癌SK0V3细胞，将Transwell小室下室进行拍照，经过立次独立实验 后，选取效果最好的结果进行对比分析，结果提示:运表示沉默P服CE对卵巢癌SK0V3细胞的 侵润能力有较强的抑制效果。
[0023] 图11.对于卵巢癌SK0V3细胞，将化answell小室下室进行计数，经过Ξ次独立实验 后，我们将对照组及试验组化ipo、阳1、阳2)侵润的细胞数进行百分比对比分析，结果提示： 数据显示沉默P服CE对卵巢癌SK0V3细胞的侵润能力有较强的抑制效果，其差距具有统计学 意义(P<0.001)。
【具体实施方式】
[0024] 本发明最初通过Thermo Fisher Scientific的I3L0CK-iT? RNAi Desi即er设计获 得了6种siRNA序列，如表1所示，通过实时定量PCR技术，检测到各组细胞P服CE mRNA的表达 水平与对照组进行对比，筛选最后得到两种能够有效的干扰PRKCE基因表达的siRNA序列 [P服CEl(PEl)和P服CE2(PE2)]，本发明首先利用设计得到的6种SiRNA序列去干扰卵巢癌 A2780和SK0V3细胞中的P服CE基因的表达，发现阳1和PE2序列使得卵巢癌A2780和SK0V3细 胞中P服CE表达水平显著降低，由此确定两种有效的SiRNA序列，PE1和PE2。
[0025] 表 1. siRNA 的序列
[0026]
[0027]~通过细胞划痕实验表明，利用筛选得到的两种SiRNA序列干扰PRKCE基因的表达可' 抑制卵巢癌A2780和SK0V3细胞的迁移能力;细胞迁移实验表明利用SiRNA序列干扰P服CE基 因的表达可抑制卵巢癌A2780和SK0V-3细胞的迁移能力;细胞侵润实验表明通过SiRNA干扰 P服CE基因的表达可抑制SK0V3细胞的侵润能力。从而证明利用设计筛选的两种S iRNA抑制 P服CE基因的表达对卵巢癌细胞迁移侵润具有显著影响。运些结果都证明了 P服CE基因的小 干扰RNA( S iRNA)在今后的卵巢癌治疗研究中的具有潜在应用价值。
[00%]本发明中在细胞逆转染实验后，通过实时定量PCR技术检测各组细胞P服CE mRNA 的表达水平时所用的PCR引物序列（生工生物工程(上海)股份有限公司）如表2所示：
[0029] 表2.PCR引物序列.
[0030]
[0031 ]实施例1.细胞的培养和传代、细胞的逆转染W及实时定量PCR技术
[0032] A2780细胞和SK0V3细胞(American type culture collection)体外分别培养于 含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM化ife Technologies公司，美国）培养基和含10% 胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基中，需要每天定期观察细胞生长状态，细胞 长满培养瓶时要及时传代(一般在贴壁细胞表面积占 80%及W上时传代）。当细胞培养和传 代效果良好