一种黄牛spag17基因插入/缺失的检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，设及基因插入/缺失（indel)的检测， 特别设及一种检测夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失（indel)的方法。
【背景技术】
[0002] 动物育种技术主要包括W表型和表型值为基础的常规育种技术和WDNA多态为基 础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，分子标记辅助选择(marker- assisted selection, MAS) 育种技术首先检测重要基因的 DNA 多态性 ，然后分析 DNA 多态与 遗传性状之间的相关性，最后再根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择。作为现 代分子生物学技术发展过程中孕育而生的新技术，MAS育种技术可W在DNA水平上快速准确 地分析个体的遗传组成，该方法通过有性杂交将目的基因转移到需要改良的亲本中，将目 标基因型的鉴定与传统育种相结合，从而实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向 性。该方法在克服表型鉴定的困难、早期选择、进行无损害的性状评价和选择及提高回交育 种效率等方面具有优越性。
[0003] 在MAS育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析 重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是分子标记辅助选择技术应用的前提和 关键。作为分子遗传标记的重要方式之一，插入/缺失（indel)是一种新型分子标记。indel 是指DM序列上核巧酸片段的插入或缺失而引起DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种 之间染色体基因组的多样性。随着对基因组研究的逐渐深入，基因组上的一种亚显微水平 的结构变异--拷贝数变异(copy number variations，CNVs)被广泛报道，现已成为"基因组 变异"到"表型变化"的另一研究热点。由于CNV设及到更多的基因序列，甚至包含整个功能 基因，因此，能够通过基因剂量效应的改变，进而影响该基因控制的表型。在近年的《Genome Research》杂志上，Bic化art等人（2012)利用全基因组测序技术，检测到了许多个与牛生 长、肉质相关的QTLs位于CNVs区域内，表明影响个体表型差异的CNVs广泛存在于基因组中。 indel是指基因组中片段长度在l-50bp之间的插入或缺失，可能包括微小CNV，利用indel分 析个体基因组可W更好地解释个体的表型差异，因此从DNA水平上对小片段核巧酸的差异 进行indel检测在动物分子育种的MS体系中具有重要意义。
[0004] 在基因组中，CNV通常发生的区域含有大片段序列重复化omologous repeats)或 SD序列（Segmen1:al duplications) eSD序列是指由于基因组重排产生的长度大于Ikb串联 重复的DNA片段，且序列之间具有90% W上的同源性(Redon et al 2006)。
[0005] CNV形成的变异机制主要有：非等位同源重组NAHR(Non-allelic homologous recombination)、非同源末端连接N肥J(Non-homologous end joining)、复制滑动 (Replication slippage)和反牵专录座（Retro transposition)。
[0006] 为探索从基因组CNVs到表型变化的作用机理，科研人员通过大量的假设和实验验 证，认为CNVs影响表型的作用机制主要有W下几个方面:1)小片段的重复、缺失/插入，改变 单个基因或与其临近的几个基因，直接导致基因剂量的改变、使相关的蛋白质的表达量的 减少或增加，进而引起表型的变化。2)DNA片段的倒位，功能基因倒位至无活性异染色体区 域，使基因不表达或表达量极少，从而导致表型的变化。3)调控基因转录调控因子，间接影 响基因表达量。
[0007] 另外，有些CNVs具有一定的干扰效应，但设及到的区域通长不会引起重要的功能 基因改变。正常个体的一个基因发生拷贝数变异不一定会导致表型的相关改变，因为很多 表型都是多基因控制的数量性状，该基因发生CNVs所产生的功能缺失会被其他功能类似的 基因补偿，从而缓冲了运种不平衡作用。所W，在群体遗传研究中，微小CNV(插入/缺失)作 为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。因此，indel在育种的研究中 具重要意义，倍受动物育种专家的青睐。
[0008] 插入/缺失（indel)是DNA或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的进化改 变，indel多态性是基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或 缺失了不同大小的小片段DNAnindel大致分成W下5大类：（1)单碱基对的插入/缺失；（2)单 一碱基的插入/缺失；（3)重复单元为2~15碱基的多碱基对插入/缺失；（4)转座子插入/缺 失；（5)任意DNA序列的插入/缺失多态性。随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究 和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的 优点，与SNP相比，均是源于单突变事件，其突变频率较低，约为10-8,相对比较稳定。在结构 上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增（< 50bp)，提高了扩增高度降解DNA的成功率。作为一种重要的遗传标记，indel的研究最早聚 焦在分子生物学及生物医学领域。遍布于整个基因组的indel频率仅次于SNP，位居第二，其 中约Ξ分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动 子区和外显子区。分子生物学家最早将其用于基因表型相关的研究，希望通过将人类性状、 疾病症状或是易感性进行联系，从而达到基因诊断和治疗的目的。2005年，Bhangale等报 道了一种能够从目的基因中全面识别indel变异的方法，并应用该方法从330个备选基因中 找到2393个indel变异位点，得出人类基因组中插入/缺失态出现的频率高于插入多态性的 结论，同时提出，indel和SNP的形成机制可能不同，但其进化史是相似的。然而相关的后续 报道并不是很多，甚至在近几年有递减的趋势。
[0009] 随着经济发展和人们生活水平的不断提高，社会对黄牛产品的需求不断加强，但 由于近年来牛肉、牛奶等产品严重短缺，所W黄牛育种专家期望更早、更好、更快地获得黄 牛产品的优良品种。在高产、优质和高效的黄牛育种目标上，黄牛育种专家一直关注生长发 育性状，但仅靠传统育种手段是不行的，还需要依靠分子育种技术。即首先在DNA水平上筛 查和检测与黄牛生长发育性状密切相关的DNA标记，然后进行基因多态性的检测，最后是进 行基因多态性与生长发育性状的关联分析，从而实现MS和实现早期诊断选择。
[0010] 精子相关抗原17(Spe;rm-associated antigen 17,SPAG17)基因，又叫做鞭毛中央 对相关(Flagellar cenhal pair-associated,PF6)基因。在人上SPAG17基因还通过影响 骨骼的生长从而影响人的身高。人类的身高是一种可遗传的典型多基因性状，是许多生长 发育过程的结果。大多数与身高相关的基因在骨骼发展中发挥作用。SPAG17基因的单核巧 酸多态性与人类身高有关。然而，目前尚不清楚运个基因如何影响线性增长。Maria 化genia Teves等(2015)表明，SPAG17基因有针对性的突变会导致骨骼崎形。后肢在突变体 长度明显短于野生型老鼠。研究显示成熟的股骨和腔骨的差异表明改变肢体模式。形态学 研究显示，通过增加骨小梁面积增加与骨区域总面积的比率可w增加骨形成，导致在股骨 骨髓面积/总面积的比率减少。通过硝酸银染色证明可W增加股骨的矿物。此外，骨巧素和 具有锋指结构的转录因子在突变小鼠股骨中比野生型老鼠中表达要高。运些数据表明，股 骨骨缩短可能是由于过早骨化。另一方面，由于软骨和骨骼发育延迟腔骨似乎稍短。形态学 研究显示，在生长板和骨的形成减少。运些缺陷并不影响骨矿化，尽管初级骨的体积和骨巧 素水平和具有锋指结构的转录因子变得更高。SPAG17基因在骨骼生长和矿化的调控，也许 因为它在初级纤毛的软骨细胞和成骨细胞的角色。Xu Kang等（2015)掲示SPAG17基因与雄 性不育相关。Silina，Karina等(2011)掲示SPAG17基因与癌症的免疫抗原相关。
[0011] 目前，对SPAG17基因的研究主要集中在与骨骼相关方面的研究上，Weedon等 (2008) ;Takeuchi等(2009) ;N'Diaye等(2011) ;Teves等(2015)研究表明SPAG17基因与人的 身高相关。对中国地方黄牛SPAG17基因遗传变异领域的研究匿乏，该基因位点的功能研究 更是空白。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法及其应用，从 而加快良种选育速度。
[0013] 为达到上述目的，本发明采用了 W下技术方案：
[0014] -种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，W待测夏南牛(黄牛品种)全基因组 DNA为模板，W引物对P1为引物，通过PCR扩增夏南牛SPAG17基因片段，该片段包含夏南牛 SPAG17基因8-bp插入/缺失多态性位点;再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳;根 据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失多态性位点的插入/缺失多 态性;所述的引物对P1为：
[0015] 上游引物：5 ' -ACATGGGAGAAATACCCG-3 ' ；
[0016] 下游引物：5 ' -GTCTGAAGATGGCAAACG-3 '。
[0017] 所述PCR的扩增反应程序为：
[0018] 1)94°C预变性5min，然后进入步骤2);
[0019] 2)94°C变性30s，复性30s，72°C延伸20s;共18个循环;第一个循环中复性溫度为68 °C，剩余每个循环中复性溫度较上一个循环降低rc，然后进入步骤3);
[0020] 3)94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸20