一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法
【技术领域】：
[0001 ]本发明设及细胞生物学技术领域，具体设及一种细胞的分离纯化及培养方法，特 别设及一种裸廳鼠皮层神经元的分离纯化和培养方法。
【背景技术】：
[0002] 神经元虽然不是是哺乳动物中枢神经系统中比例最高的，但却是功能最重要的一 类细胞，神经元在突触形成、突触信号传递，W及突触可塑性中发挥着至关重要的作用。而 大脑皮层神经元在机体诸多功能，包括视觉、听觉、嗅觉、语言、运动、体表感觉等方面发挥 着控制中枢的作用。
[0003] 裸廳鼠是一种变溫哺乳动物，在氧气浓度仅有6%左右的不通风桐穴中能够保持 脑结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动。裸廳鼠常年生活与地下黑暗狭窄的桐穴 中，裸廳鼠视觉功能严重退化，只能感受到无定形的光线信号，但无法接收清晰的图像信 号，视觉中枢萎缩，远不及其他视力正常的晒齿类动物（Mills SL，Catania KS(2004) Identification of retinal neurons in a regressive rodent eye(the naked mole-rat) .Vis Neurosci 21:107-117.；Nikitina N,Maughan-Brown B,民iain MO,Kidson S (2004)Postnatal development of the eye in the naked mole rat(Heterocephalus glaber).Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 277:317-337.；Hetling JR,Baig-Silva MS,Comer CM，et al.(2005)Features of visual function in the naked mole-rat Heterocephalus glaber.J Comp Physiol ANeuroethol Sens Neural Behav Physiol 191:317-330.)。听觉系统及听力也到了一定程度的削弱。首先外耳廓在进化过程 中消失，在耳开口处只有由皮肤组成的环状结构。其次，其声源定位能力障碍，只能辨识W 泥上为传播介质的化频声音化effner RS，Heffner HE(1993)Degenerate hearing and sound localization in naked mole-rats(Heterocephalus glaber)with an overview of central auditory struc化res .J Comp Neurol331:418-433.) D 另外其对空气中传播 的气味分子的嗅觉能力严重受限。但是，裸I晏赢其他功能则代偿性增强:其发达的终生保持 增生能力且功能强大的切牙可^从事高强度的挖掘工作;在与其身体直径相当的洞穴中， 裸黯赢主要依赖其体表数根触须发挥的触觉功能代偿其严重退化的视力和听力。这些生理 功能的变化可能主要是其脑内对应脑区的形态结构和功能出现适应性的变化造成的 (Catania KC,Remple MS(2002)Somatosensory cortex dominated by the representation of teeth in the naked mole-rat brain.Proc Natl Acad Sci U S A99:5692-5697.；Crish SD,Rice FL,Park TJ,Comer CM(2003)Somatosensory organization and behavior in naked mole-rats I: vibrissa-1 ike body hairs comprise a sensory array that mediates orientation to tactile stimuli.Brain Behav Evol 62:141-151.;Park TJ,Comer C,Carol A，et al.(2003)Somatosensory organization and behavior in naked mole-r过ts:II.Peripher过I structures， innervation, and selective lack of neuropeptides associated with thermoregulation and pain.J Comp Neurol 465:104-120.；Henry EC,Remple MS,0' Riain MJ,Catania KC(2006)Organization of somatosensory cortical areas in the naked mole-rat巧eterocephalus glaber).J Comp 化urol 495:434-452.)。裸廳鼠大脑 皮层功能及其机制的阐明除了需要在体功能的研究，还需要对其特定大脑皮层神经元的研 究，运就依赖于其大脑皮层纯化培养的神经元。
[0004] 目前，研究人员已经建立出大鼠及小鼠皮层神经元的培养方法化in Gang,化-chen Yao,Ying-fu Liu,Yi-peng Li,Kai Yang,Lei Lu,Yuan-chi Cheng,Xu-yi Chen,and Yue Tu.Co-culture of oligodendrocytes and neurons can be used to assess drugs for axon regeneration in the central nervous system.Neural Regen Res.2015； 10 (10):1612-1616.)。
[0005] 中国专利申请CN201110164446.4,申请公布号为CN102839151A，公开了一种胎鼠 皮层神经元的原代无血清培养方法，所述的培养基为膜岛素一转铁蛋白一亚砸酸钢无血清 培养基，其中含有0.5g/L膜岛素、0.5g/L转铁蛋白和0.5mg/L亚砸酸钢。
[0006] 中国专利申请CN201510072161.6,申请公布号为CN104611294A，公开了一种大鼠 视皮层神经元体外培养方法，贴壁培养时先用接种培养基，1化后用维持培养基全换液;所 述的接种培养基为DMEM/F12培养基中加入体积比为10%的马血清、2 X IO5IVL的青链霉素 和0.5111111〇1/1的心谷氨酷氨;所述的维持培养基指化urobasal Medium无血清培养基中加入 体积比为2%的B27血清替代物和2X105U/L的青链霉素W及0.5臟〇1/1^化-谷氨酷氨。
[0007] 但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的皮层神经元分离纯化和培养方法均不适用 于裸廳鼠，目前国内外文献尚无有关裸廳鼠皮层神经元分离纯化和培养方法的相关报道。
【发明内容】
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[0008] 本发明的目的在于提供一种裸廳鼠皮层神经元的分离纯化和培养方法，W便捷、 高效的获得纯度高、状态好的裸廳鼠皮层神经元，为体外建立裸廳鼠皮层神经元提供技术 支持，同时为体外研究裸廳鼠皮层神经元的活化、W及低氧耐受能力、W及裸廳鼠皮层神经 元低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或祀分子的筛选提供强大的保障。
[0009] 我们试用了目前小鼠、大鼠的皮层神经元分离纯化和培养方法，结果发现均无法 培养获得纯度高、状态好的裸廳鼠皮层神经元，而且裸廳鼠皮层神经元增殖的数量也较少。
[0010] 关于裸廳鼠皮层神经元的培养尚没有建立出可行的实验方法，我们分析其原因， 主要是：1)裸廳鼠是一种变溫动物，其体细胞离体培养的溫度有待摸索，并且其不恒定的机 体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸廳鼠生存在较为阴暗 潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求;3)裸廳鼠已经适应了外界低氧的环 境，所W其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸 索。4)裸廳鼠妊娠周期长达两个月W上，而大鼠及小鼠仅需3周，因此在选择胎鼠进行实验 的时间需要仔细摸索。
[0011] 因此，裸廳鼠皮层神经元的培养中最重要的摸索到合适的溫度、湿度和氧气浓度， W及摸索到适合的妊娠周期和培养基。
[0012] 为达到此目的，本发明的裸廳鼠皮层神经元的分离纯化方法包括W下步骤：
[0013] A、收集裸廳鼠皮层混合神经细胞：
[0014] 分离65-70天的胚胎裸廳鼠大脑皮层组织，将大脑皮层组织剪碎，加入组织消化液 混匀之后，于35-37°C消化15-30分钟;然后用混合神经细胞培养基终止消化，离屯、去除上清 之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液;将单细胞悬液种于无菌 且预先包被有基质层的24孔板中；
[0015] 所述的组织消化液，可W为常规的蛋白水解酶类消化液，例如膜蛋白酶、木瓜蛋白 酶等，辅WDNA酶IW解除DNA片段粘连所致的细胞聚集。优选的组织消化液:含有所述组织 消化液为含有质量浓度0.25%的膜酶和终浓度为0.08mg/ml DNA酶的混合液。
[0016] 所述的基质层，可W为常规的左旋多聚赖氨酸、右旋多聚赖氨酸等。优选的基质层 为laminin。
[0017] B、裸廳鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：
[0018] 将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于=气培养箱中培养 6-10个小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2-4天，然后将培养基 更换为神经元维持培养基继续培养2-4天，如此为一个循环，培养2-4个循环。
[0019] 所述的混合神经细胞培养基可W为常规含血清混合神经细胞培养液，例如低糖 DMEM等。优选为含有体积百分数为10 %胎牛血清的低糖DMEM。
[0020] 所述的神经元纯化培养基为含有IOiiM 5-氣尿喀晚的化robasal培养基并添加体 积分数为2%的B27。
[0021] 所述的神经元维持培养基为含有体积百分数为2%B27的化urobasal培养基，同时 添加lOOng/ml NGF。
[0022] 所述的=气培养箱的参数设置为:溫度控制在35±2°C，氧浓度为5%，二氧化碳浓 度为5±1%，湿度为96±2%。
[0023] 进一步，步骤A中，分离65-70天的胚胎裸廳鼠大脑皮层组织的方法如下：取怀孕 65-70天的雌性裸廳鼠，将其在C〇2中作窒息处理后立即将其浸泡于75%的乙醇中进行消 毒，然后将其置于无菌玻璃平皿中，小屯、剖腹并将其含有胎鼠的子宫完整取出，剪开子宫膜 并小屯、取出胎鼠。将胎鼠烦骨剪开，于体式显微镜下将左右大脑从正中线分成两半，然后小 屯、剥离皮层，并剥除皮层表面的脑膜结构。
[0024] 进一步，步骤A中，用显微剪将皮层组织剪碎至Imm3,加入组织消化液混匀之后，于 37°C 消化 20min。
[0025] 进一步，步骤B中，于=气培养箱中培养8小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元 纯化培养基继续培养2天，然后将培养基更换为神经元维持培养基继续培养2天，如此为一 个循环，培养2个循环。
[00%]进一步，所述=气培养箱的参数设置为:溫度控制在35°C，氧浓度为5 %，二氧化碳 浓度为5%，湿度为96 %。
[0027] 中国专利申请201410066546.7,申请公布号为103789266A中公开了一种大脑皮层 神经元分离和原代培养方法，其中细胞维持液用于大鼠皮层神经元的培养。但是考虑到从 皮层中获取的神经细胞包括皮