一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
【背景技术】
[0002] 支原体(Mycoplasma)，又称霉形体，属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，其大小介 于细菌和病毒之间，是目前已知的能够在无生命培养基中生长繁殖的最小原核微生物，并 能够通过0.22WI1的细菌滤器。由于支原体缺乏细胞壁，因此具有多形性，且对作用于细胞壁 的抗生素有抵抗力。在固体培养基上，支原体菌落呈露滴状、煎蛋样或颗粒状。自1898年法 国科学家Nocard等人首次从呼吸道疾病患病牛肺脏组织中分离出该类微生物W来，人、动 物、植物及昆虫源性的此类微生物相继被分离鉴定。1967年，该类微生物被国际细菌命名委 员会正式命名为支原体并沿用至今。迄今为止，分离鉴定的支原体已达190种W上，其中许 多种类可对人、动物、植物及昆虫致病，造成极大危害。
[0003] 牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)是牛呼吸系统疾病的主要病因之一，其感染可 导致牛的肺炎、耳炎、关节炎、精囊炎、乳房炎、生殖道炎症、流产及不孕症等疾病。1961年， 美国人化Ie等首次在乳房炎患病牛中分离到该病原，1976年，其致病性被证实。此后，牛支 原体感染迅速向世界各地传播蔓延，并遍布欧洲、大洋洲、美洲W及亚洲。其中W欧洲最为 严重，所造成的损失亦最为惨重。仅在英国，每年约有190万头牛感染发病，且死亡率高达 82.%，经济损失约为5400万英镑(1?66乂6-化11113〇11，1999)。而美国牛群中牛支原体感染率高 达70%，每年的经济损失约为1.08亿美元(Rosenga;rten and Citti ,1999)。在我国，黎济申 等人于1983年首次从国内乳腺炎病牛的乳汁分离到牛支原体，证实了我国牛群牛支原体感 染的存在。2008年，辛九庆等人从传染性坏死性肺炎病死辖牛肺脏中分离出牛支原体，随后 证实该病在全国大部分地方普遍流行，且其发病率高达50 % -100 %，病死率通常为10 % -50%。由于目前尚无理想的疫苗进行预防，加之该病原具有多重耐药性，因此，该病给我国 养牛业造成了巨大的经济损失。基于此，快速、准确的牛支原体检测方法的建立，必将为该 病的有效防控奠定基础。
[0004] 目前，牛支原体肺炎的诊断W实验室诊断为主。虽然分离和鉴定牛支原体的方法 最为确实，但其耗时较长。而用常规的抗体检测方法诊断牛支原体肺炎则灵敏度低，非特异 性高。虽然PCR和环介导等溫扩增技术灵敏度高，但却极易因核酸的污染而出现假阳性，且 PCR技术需要特殊的仪器设备，因此其难W普及。应用单克隆抗体建立的牛支原体检测方 法，虽然灵敏度较高，但通常难W对牛支原体和无乳支原体进行有效鉴别。
【发明内容】
[0005] 本发明针对目前检测牛支原体存在的问题，提供了一株能产生与牛支原体发生抗 原抗体反应的I gG 1亚型抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
[0006] 本申请人通过对牛支原体基因组的分析，发现牛支原体不同菌株的脂蛋白P48基 因高度保守，国内外来源的不同菌株其脂蛋白P48基因序列完全一致。而该基因序列与无乳 支原体的相关基因序列存在一定的差异，两者的同源性约为80%左右。因此，申请者设计引 物对牛支原体脂蛋白P48基因进行了扩增和原核表达，W纯化的表达产物为抗原免疫BaA/ C小鼠，在细胞融合的基础上筛选出了可分泌牛支原体特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，并 利用所分泌的单克隆抗体，建立了特异强、灵敏高的牛支原体双抗夹屯屯LISA检测方法。
[0007] 本发明提供一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为:CCTCC C2015183，保藏日期为:2015年11月8日，细胞分类命名为:杂交瘤细胞株NZYT-ZJC，保藏单 位为：中国典型培养物保藏中屯、，保藏地址为:湖北省武汉市武汉大学。
[0008] 本发明还提供由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0009] 本发明的第=个目的是提供单克隆抗体的制备方法，是将权利要求1所述的杂交 瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得的。
[0010] 作为优选方案，步骤如下：向小鼠腹腔注射0.5mL的液体石蜡，9天后，每只小鼠腹 腔注射5 X IO5-IO6个杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，4°C，120化/min离屯、 3min，收集中间层，获得单克隆抗体。
[0011] 本发明的第四个目的是提供杂交瘤细胞株的应用，将杂交瘤细胞株产生的单克隆 抗体用于检测牛支原体。
[0012] 作为优选方案，将所述的单克隆抗体配置在检测牛支原体的免疫试剂盒中。
[0013] 作为优选方案，将所述的单克隆抗体制成用于检测牛支原体的胶体金免疫试纸 条。
[0014] 本发明的第五个目的是提供检测牛支原体的间接法酶联免疫试剂盒，包括一抗， 所述一抗为权利要求1所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
[0015] 作为优选方案，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗。
[0016] 本发明的第六个目的是提供检测牛支原体的胶体金免疫试纸条，包括胶体金垫， 胶体金垫中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
[0017] 本发明的优点在于:本发明所获得的细胞株能够特异性的分泌针对牛支原体的单 克隆抗体，具有较好的灵敏度和较高的特异性，能够对牛支原体和无乳支原体进行有效鉴 另IJ。本发明的优点还在于:利用本发明获得的细胞株所产生的抗体能够应用于多种途径，对 实际生产有较好的应用价值。
【附图说明】
[0018] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0019]图巧P48基因的PCR分段扩增；
[0020] 图2为牛支原体武威株P48基因 PCR扩增及重组质粒祀T-P48电泳图；其中，A为牛支 原体武威株P48基因 PCR扩增产物电泳图，M为化5000 DNA Marker; 1:牛支原体武威株P48基 因；B为重组质粒祀T-P48电泳图，其中，M:DL2000 DNA Marker;l:pET-P48重组质粒；
[0021] 图3为P48蛋白原核表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定；其中，M:预染的蛋白分子质量 标准；1: PET-P48 未经 IPTG 诱导；2: PET-P48 经 IPTG 诱导；3: PET-P48 裂解后上清；4: PET-P48 裂解后沉淀;5:纯化后的P48蛋白；
[0022] 图4为本发明的单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE鉴定图；1:纯化后的单克隆抗体;M: 预染的蛋白分子质量标准；
[0023] 图5为本发明的单克隆抗体的化ISA检测特异性分析；
[0024] 图6为本发明的单克隆抗体的特异性分析。其中，A中：M:预染的蛋白分子质量标 准；1:牛支原体;2:沙雷氏菌;3: pET-28a; 4:绿脈杆菌;5:无乳支原体;6:沙口氏菌;B中：M: 预染的蛋白分子质量标准；1:牛支原体;2:己氏杆菌;3:鸡毒支原体;4:大肠杆菌;5:金黄色 葡萄球菌;6:变形杆菌；
[0025] 图7为两株单克隆抗体亚类的鉴定结果。
【具体实施方式】
[0026] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0027] 实施例1牛支原体特异性单克隆抗体的制备 [002引 1实验材料
[0029] 1.1质粒、菌株、细胞及实验动物
[0030] 祀T-28a( + )由甘肃农业大学动物医学院预防兽医学实验室保存;牛支原体武威分 离株及临挑分离株（分别从甘肃省武威市和临挑县发病牛群分离；牛支原体化bei-1株、 PG45及无乳支原体PG2由华中农业大学惠赠;E.coli D册a、BL21(DE3)购自北京天根生化科 技有限公司；粘质沙雷氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脈杆菌、己氏杆菌、大肠杆菌、沙 口氏菌由本实验室保存;SP2/0骨髓瘤细胞由军事兽医研究所雇荣良研究员实验室惠赠;新 西兰大白兔6周龄SPF雌性BALB/C小鼠