杂交瘤细胞株4C9及其产生的抗His标签蛋白单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，涉及杂交瘤细胞株4C9及其产生的抗His标签蛋白单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]His标签是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸HHHHHH，其特点是分子量小，基本不改变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性，更重要的是它使蛋白质的纯化变得极为方便，根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白，即将含有目的蛋白的裂解液通过固定的二价金属离子(通常是二价Ni离子)填料，带有6*his标签的蛋白质即与填料结合，其它蛋白不与填料结合，最后再用高浓度的咪唑即可将目的蛋白洗脱下来。
[0003]His标签融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱(MAC)进行纯化。頂AC是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。1987年Smith et al.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA_sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-1DA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合MAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-1DA_sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-1DA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。尽管该技术已较为成熟，但该类填料价格一直居高不下。因此，研制出抗His标签蛋白的单克隆抗体，并建立其相应的重组蛋白鉴定和浓度测定技术，对于His重组蛋白纯化的质量检测具有较强的必要性。
[0004]本发明利用带His标签蛋白免疫小鼠后利用杂交瘤技术筛选出可高效识别Hi s标签单克隆抗体的杂交瘤细胞株AdHis标签单抗可以用来鉴定His标签的蛋白质的表达情况，并与重组蛋白组合，用于重组蛋白的浓度测定。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株杂交瘤细胞株4C9，该细胞株已于2015年12年16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCN0.C2015198，分类命名为杂交瘤细胞株4C9;其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的抗His标签蛋白单克隆抗体轻链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO: 2所示的抗His标签蛋白单克隆抗体重链可变区编码基因序列。
[0006]本发明另一目的是提供一种抗His标签蛋白单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCCN0:C2015198的杂交瘤细胞株4C9分泌产生；其轻链可变区具有序列表中SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列；重链可变区具有序列表中SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；该抗His标签蛋白单克隆抗体可以识别所有带有His标签的重组蛋白。
[0007]本发明另一目的是将抗His标签蛋白单克隆抗体应用在带His标签重组蛋白表达情况检测和浓度测定中。
[0008]本发明提供的杂交瘤细胞株4C9是采用两个带有相同His标签的不同重组蛋白分别作为免疫原和检测原进行免疫和筛选获得的，其具体步骤为:将基因工程表达的带His标签重组狂犬病毒L蛋白作为免疫原，对BALB/c小鼠免疫3-5次，加强免疫于细胞融合3天前以不含佐剂的2倍抗原剂量进行。采用双抗原同步检测ELISA方法进行筛选融合细胞:第一采用带His标签重组狂犬病毒L蛋白进行筛选以排除不产生抗体的阴性细胞及针对免疫原以外抗原的克隆；第二以带His标签的重组HCV NS3蛋白筛选，对两种抗原均产生强阳性反应的克隆进行有限稀释，12天后采用带His标签重组HCV NS3蛋白进行抗体检测，重复2-3次，直到所有亚克隆孔均呈阳性反应时，即筛选获得杂交瘤细胞株4C9。
[0009]本发明提供的抗His标签单克隆抗体的制备方法，步骤如下:将获得的杂交瘤细胞株4C9注射预先用灭菌液体石蜡处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗His标签蛋白单克隆抗体。
[0010]按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为:腹水4°C12000 rpm离心15min，去除杂质。取I份腹水与2份醋酸盐缓冲液(0.06M NaAc)混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸33yl/mL腹水。室温混合30 min，4°C静置2h以上，使其充分沉淀。4 °C ,12000rpm离心30 min，弃沉淀。上清经砂芯漏斗或125μηι的尼龙网过滤后，加入1/10体积的0.1MpH 7.4 PBS，用2M NaOH调pH值至7.4。冰浴下在301^11内加入0.2778/1^的硫酸铵，使成45%饱和度。4 °C静置Ih以上。4°C，10000 rpm离心30min，弃上清。沉淀用适量含137mM NaCl,2.6mM KCl、0.2mM EDTA的pH 7.4 PBS溶解，于50?100倍体积的上述PBS中4 °(:透析过夜。取少量透析后样品适当稀释后，以紫外分光光度计检测蛋白含量，SDS PAGE检测抗体纯度。
[0011]本发明的优点及有益效果
(1)本发明提供的杂交瘤细胞株4C9可以用于制备高效价抗His标签蛋白单克隆抗体，抗His标签蛋白鼠腹水抗体酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的效价可达1.28 X 16；
(2)本发明提供的抗His标签蛋白单克隆抗体可应用于带His标签蛋白的重组蛋白的鉴定和含量测定。
【附图说明】
[0012]图1为用纯化后的本发明杂交瘤细胞株4C9C2015198分泌的单克隆抗体在检测带His标签重组蛋白的免疫印迹图；图中M:分子质量标记；1:诱导前的全菌蛋白质样品；2:诱导表达细菌超声破碎的全菌体蛋白质样品；
图2为竞争性ELI SA方法检测带Hi s标签重组蛋白的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0013]下面用实施例对本发明做进一步阐述，应当理解为，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制，本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所做的任何变动都将落在权利要求书的范围内，实施例中百分比均为体积百分比。
[0014]实施例1:杂交瘤细胞株4C9的制备
1、免疫和检测原的制备及动物免疫
作为免疫原的带His标签重组狂犬病毒L蛋白的载体构建和蛋白表达与纯化的具体过程参见文南犬Zhang J, Jin Z, Sun T, et al.Prokaryotic Express1n, Purificat1n,and Polyclonal Antibody Product1n of a Truncated Recombinant Rabies Virus LProtein[J].1ranian Journal of B1technology, 2015， 13(2): 18-24.而同样带His标签蛋白的重组HCV NS3蛋白的原核表达载体构建及蛋白纯化的具体步骤参见文献孙涛，杨光文，张金阳，等.丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[J].生物工程学报，2015，31(5): 711-712.以纯化的带His标签重组狂犬病毒L蛋白对6-8周龄雌性BALB/c小鼠3只进行免疫。第一次免疫将重组蛋白与等体积福氏完全佐剂混合乳化充分，于小鼠腹、背部皮下多点注射，剂量为50yg/只。第二次免疫于首免2周后进行，采用福氏不完全佐剂与重组蛋白等体积充分乳化，小鼠皮下注射。第三次免疫在第二次免疫后两周进行。在第二次免疫结束后，即以尾静脉采血，测定血清中抗体效价。当血清效价达到10000以上时，选择效价最高的小鼠以腹腔和尾静脉注射冲击免疫，剂量为60?/只。
[0015]2、细胞融合
加强免疫3天后，以50%聚乙二醇(分子量1450)作为融合剂进行细胞融合。将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0以个数比3:1混合，再缓慢(111^11内加完)加入0.81^预热至371€的50% PEG1450，作用时间为90s，再以预热至37°C的无血清无抗生素的RPMI1640基础培养液重悬细胞，100rpm离心7min去除融合剂PEG1450，再以含20%胎牛血清(体积比)的HAT完全培养基重新悬起细胞，以200yL/孔铺于96孔板中，于37°C，5% CO2培养箱中培养，在融合后第5天，以50-100μ!7孔的HAT培养液对细胞进行补液。
[0016]3、间接ELISA筛选阳性细胞株
在融合后12天，细胞量大约占孔底2/3，取10yL上清进行ELI SA筛选。
[0017]上述间接ELISA筛选抗His标签阳性细胞的具体步骤如下:
(1)抗原包被:以浓度为2yg/mL的重组HCVNS3蛋白包被于96孔酶标板，4°C孵育过夜，以含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤一次；
(2)封闭:以含5%脱脂奶的磷酸盐缓冲液作为封闭液，37°C作用I小时，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤一次；
(3)培养上清