水稻细胞质激酶基因OsBHL1及其编码蛋白与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体设及一种水稻细胞质激酶基因 OsB化1及其编 码蛋白与应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人W其为主食，同时水稻也是 目前农业生产和科学研究的热点植物，作为科学研究的模式植物，在完成水稻全基因组计 划之后，其功能基因组的研究得到越来越多的广泛关注，特别是对一些调控水稻重要农业 性状基因的研究日益受到研究人员的重视。
[0003] 受体类蛋白激酶在植物生长、发育和防御反应中起重要作用。一般受体类蛋白激 酶包括4个结构域:N-端信号肤、细胞外受体识别、单次跨膜和细胞质内的蛋白激酶结构域。 细胞外的结构域结合配体后激活细胞内的激酶活性，可诱导下游蛋白的转憐酸化和自憐酸 化过程，憐酸化的蛋白可进一步的诱导此配体引起的特异性反应。尽管受体类蛋白激酶在 植物基因组中包含一个很大的家族，并且大量的基因已经克隆，但是运些蛋白的功能知道 的还是很少。
[0004] 叶片卷曲是水稻生产中一个重要的农艺学性状，适度的叶片卷曲可使叶片直立， 增加光合作用效率，通过降低蒸腾作用水分的丧失和增加热的吸收提高应急反应。然而对 于叶片卷曲的分子学机制还知道很少。
[0005] 对于激酶基因多效应的研究报道也比较多，例如水稻类凝集素受体蛋白基因 Oslec服参与发芽和抗性、Ca2+依赖的蛋白激酶CDPK7参与水稻的耐冷、耐盐和耐旱、受体激 酶BAKl可通过BR信号调控生长发育，也可通过识别flg22或者ERF参与PTI调控的抗性反应 AfrAfr 寸寸O
【发明内容】
[0006] 为了进一步研究控制水稻叶片卷曲的分子机理，本发明的目的在于提供一种水稻 细胞质激酶基因 OsB化1及其编码蛋白与应用。
[0007] 本发明提供水稻细胞质激酶基因 OsB化1，所述基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，该基因全长2433bp，具有5个内含子和6个外显子，其CDS区段分别为1-706、808-969、 1230-1314、1397-15:34、1621-1235和2098-2433，cDNA全长 1567bp，如SEQ ID NO. 3所示，其 ORF为cDNA的238-1416bp。
[000引本发明技术人员应当理解根据SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列，对其替换、缺失 和/或增加一个或几个核巧酸，获得具有相同功能的核巧酸序列，例如，在不同水稻背景下 的序列，替换一个或几个碱基。因此，本发明所述的基因还包括SEQ ID No.1所示的核巧酸 序列经替换、缺失和/或增加一个或几个核巧酸，且具有相同功能的核巧酸序列。
[0009]进一步地，本发明还提供了所述基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]应该理解为，在不影响WlLl蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中屯、），本领域 技术人员可对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨 基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
[0011] 因此，本发明的水稻BHLl基因编码的蛋白质还包括SEQ ID NO.2所示氨基酸序列 经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的水稻BHLl基因编码的蛋白质。 此外，应理解，考虑到密码子的简并性W及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可W 根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0012] 本发明还包括基于所述多核巧酸的正义序列或反义序列，包括含有所述多核巧酸 序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核巧酸序列或 其片段的转化的植物细胞和转基因植物。
[0013] 本发明还提供了所述基因在水稻选育中的应用，所述水稻选育为提高水稻叶片卷 曲度和直立性W及对褐飞風的抗性。
[0014] 本发明还提供一种培育具有一定褐飞風抗性的植物的方法，包括：
[0015] 1)用多核巧酸转化植物细胞;所述多核巧酸含有水稻细胞质激酶OsBHLl基因的 0RF，其核巧酸序列如沈Q ID N0.3的238-1416bp所示；
[0016] 2)将被转化的植物细胞再生为植物；
[0017] 3)培养再生的植物并使上述多核巧酸得到过量表达。
[0018] 其中所述植物是单子叶植物。
[0019] 所述单子叶植物是水稻。
[0020] 本发明还提供了水稻细胞质激酶基因 OsBHLl转基因植株的分子检测方法，通过所 述引物对扩增待检转基因水稻基因组DNA，并检测扩增产物:若利用引物OES-F和OES-R扩增 出457bp的扩增片段，则说明是转基因阳性植株，若没有扩出运个片段则说明是转基因阴性 植株。
[0021] OsB化1基因的发现与研究实验进展：
[0022] 1)发现过程:通过对类凝集素受体蛋白激酶Lec服在水稻9311文库筛选互作蛋白 找到一个细胞质激酶蛋白OsB化1。
[0023] 2)遗传转化验证功能:本发明的基因来源于釉稻B5的基因组W及CDNA。将OsBHLl 的ORF全长连入到含有Ubi启动子的载体PCXUN中，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法， 将过表达载体导入正常梗稻品种合江19化1493)中，最后获得OsB化1转基因植株25株。
[0024] 筛选引物分别是
[00巧]〇ES-F:GTCGCTGTGCATCCGCTCGT(5，-3，）（SEQ ID N0.8)
[00%] 〇ES-R:GTTTGCGCGCTATATTTTGT(5'-3'）（SEQ ID N0.9)
[0027] 其中阳性植株17株，然后对Tl代的植株进行了Southern杂交、定量PCR分析，随机 挑选3个具体代表性的单拷贝进行后续分析，分别是06-22、06-24、06-25，表达程度上依次 增高。
[0028] 对T2代的纯合阳性植株进行田间性状考察，包括，叶片卷曲指数、叶片直立指数、 叶片宽度、叶片长度、分葉数、株高、结实率、千粒重、穗长、穗数、结实率进行性状考察。
[0029] 对T2代的纯合阳性植株在苗期进行选择性实验，实验表明褐飞風更喜欢在野生型 H1493上取食，而在OsBHLl超量表达的转基因植株上分布较少，说明Os册Ll基因正向调控对 褐飞風的抗性。
[0030] 本发明的优点和效果：
[0031] 1.是对细胞质激酶基因参与水稻生长发育过程的一个很好的实例，运对理解激酶 功能和对生长发育调控具有一定的参考价值。
[0032] 2.本发明报道了细胞质激酶基因参与了对褐飞風的抗性，运对研究水稻对抗褐飞 風是一个新的认识。
[0033] 3.由于OsBHLl基因的具有很好的多效性，而且叶片卷曲和直立性对水稻的高产、 稳产都具有重要意义，因此此基因可W用于育种工作中。
[0034] 4.由于植物细胞中，激酶是一个很大的家族，因此OsBHLl基因的研究对于研究工 作者W后研究其他的激酶基因具有很好的参考价值。
【附图说明】
[0035] 图1为OsB化1基因的组织表达模式
[0036] 呈现组成型表达模式，在各个时期都有表达，但是在叶片中表达量比较高，特别是 剑叶中达到最高。
[0037] 图2为转基因材料的Southern杂交结果。
[0038] 图3为转基因材料的定量PCR结果。
[0039] 图4为转基因株系0E-25的植株表型
[0040] 与对照化493相比，分葉数变少、叶片卷曲比较明显(标尺代表10厘米长度）。
[0041 ]图5为OsB化1基因过表达植株的表型分析
[0042] 卷曲指数（图5A)和叶片直立指数（图5B)。
[0043] 图6为不同转基因株系株高（图6A)、分葉数（图6B)、穗数（图6C)、结实率（图6D)、千 粒重（图6E) W及叶片叶绿素含量(图6F)。
[0044] 图7为褐飞風对株系0E-25与对照化493的选择结果。
[0045] 图8为不同转基因株系抽穗期剑叶的横切图（图8A，B，C，D) W及对应的泡状细胞数 目（图8E)及面积（图8巧。
【具体实施方式】
[0046] 通过W下详细说明结合附图可W进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不W任何方式限制本发明掲示的其余内容。
[0047] 若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段;所用的实 验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷 泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成;所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
[004引【实施例1】水稻OsB化1基因的获得
[0049] 通过对类凝集素受体蛋白激酶LecRK在水稻9311文库筛选互作蛋白找到一个细胞 质激酶蛋白OsB化1，通过设计引物在釉稻B5的CDNA中扩增得到基因的ORF序列，通过与数据 库中的日本晴序列比对，发现只有3个核巧酸差异，在本发明中可理解为同一个基因的不同 水稻品种的差异，然后通过日本晴序列设计引物扩增得到基因序列。
[0050] 【实施例2】水稻OsB化1基因表达模式
[0051] 为了了解OsBHLl基因的表达情况，取H14