大豆MicroRNA172在培育耐逆植物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大豆MicroRNA172在培育耐逆植物中的应 用。
【背景技术】
[0002] 环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发 育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之 一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途 径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植 物中已经发现了多类蛋白激酶、转录因子等与植物耐逆性相关，但是，有关MicroRNA与耐 逆性的相关性报道较少。
[0003] MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核巧酸的小RNA，其在细胞内 具有多种重要的调节作用。MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为 300-1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约 为70-90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24nt的成熟miRNA。
[0004] 在植物中，miRNA在RISC的作用下与祀基因的mRNA结合后，通过降解mRNA或抑 制翻译的方式对基因的进行调控。每个HiiRNA可W有多个祀基因，而几个miRNA也可W调 节同一个基因。送种复杂的调节网络既可W通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可 W通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。植物中已知miRNA通过调控与植物 开花及花器官发育相关基因的表达，参与植物生殖发育及花器官分化。一些miRNA调控植 株的发育和耐逆性，例如玉米中铅胁迫响应miRNA与植株的耐铅胁迫相关；海南大学薄维 平等分析了木墓低温下miRNA的差异。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供MicroRNA172 (简称为miR172)或其编码核酸分子或含 有其编码核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的新用途。
[0006] 本发明提供了 MicroRNA172或其编码核酸分子或含有其编码核酸分子的重组载 体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物和/或提高植物生物量中的应用；
[0007] 所述MicroRNA172的核巧酸序列为序列表中序列2或序列3。
[0008] 上述序列表中序列2所示的RNA为pre-miRNA172,序列3所示的RNA为 MicroRNA172, pre-miRNA172 为 MicroRNA172 的前体。
[0009] 上述应用中，所述MicroRNA172编码核酸分子的核巧酸序列为序列表中序列1，编 码 pre-miRNA172〇
[0010] 上述应用中，所述含有Mi Cr0RNA17 2编码核酸分子的重组载体为将所述 MicroRNA172编码核酸分子插入表达载体得到表达MicroRNA172的重组载体，在本发明的 实施例中，表达载体为地in438,重组载体为将序列表的序列1所示pre-MicroRNA172的编 码核酸分子插入地in438载体BamHI和化nl酶切位点之间得到的载体，且插入的位置在 CaMV35S启动子之后，将该重组载体命名为地in438-pre-MicroRNA172〇
[0011] 上述应用中，所述耐逆性为耐盐性；
[0012] 所述提高生物量体现在提高根长、提高株高和/或提高地上部分鲜重。
[0013] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，在本发明的实施例中，采用的 双子叶植物为大豆。
[0014] 本发明另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0015] 本发明提供的方法，为将MicroRNA172编码核酸分子导入目的植物，得到转基因 植物；
[0016] 所述转基因植物具有如下1)和/或2)特征：
[0017] 1)所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；
[0018] 2)所述转基因植物的生物量大于所述目的植物；
[0019] 所述MicroRNA172的核巧酸序列为序列表中序列2或序列3。
[0020] 上述方法中，所述MicroRNA172编码核酸分子通过重组载体导入所述目的植物；
[0021] 所述重组载体为将所述MicroRNA172编码核酸分子插入表达载体得到表达 MicroRNA172的重组载体；
[0022] 所述MicroRNA172编码核酸分子的核巧酸序列为序列表中序列1。
[0023] 上述方法中，所述耐逆性为耐盐性；
[0024] 所述生物量体现在提高根长、提高株高和/或提高地上部分鲜重。
[0025] 上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物为大豆。
[0026] 上述耐盐体现在盐胁迫下提高根长、提高株高、提高地上部分鲜重和/或降低电 导率。
[0027] 使用Pre-miR172构建重组植物表达载体时，在其转录起始核巧酸前可加上任何 一种增强型启动子或组成型启动子，如花挪菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启 动子扣biquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基 因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，送些增强子区域 可W是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，W保 证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可W是天然的， 也可W是合成的。翻译起始区域可W来自转录起始区域或结构基因。
[0028] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 蛮光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡郝霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莽剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接W干旱或高盐处理筛选转化植株。
[0029] 利用任何一种可W引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的大豆 Pre-miR172导入植物细胞，可获得对高盐逆境胁迫耐受力增强、且生物量增加的转基因植 株。携带有Pre-miR172的表达载体可通过使用Ti质粒、化质粒、植物病毒载体、直接DNA 转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植 物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可W是单子叶植物，也可W是双子叶植物，如：大 豆、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、首宿等。
[0030] 本发明的实验证明，本发明过表达pre-miR172得到转基因大豆，其高于转空载体 大豆或野生型大豆，具体体现在盐胁迫下生物量高于转空载体或野生型大豆。本发明对培 育耐盐且生物量增加的植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。
[0031] 下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
【附图说明】
[0032] 图1为miR172在各器官中的表达
[0033] 图2为miR172受高盐/干旱处理诱导
[0034] 图3为植物表达载体地in438-miR172的图谱 [00巧]图4为转pre-miR172大豆分子鉴定
[0036] 图5为正常条件下转pre-miR172大豆的表型分析
[0037] 图6为SOmM化Cl处理时转pre-miR172大豆表性分析
[0038] 图7为SOmM化Cl处理后转pre-miR172大豆叶片和根表型
[0039] 图8为转pre-miR172大豆生理指标统计
[0040] 图9为转pre-miR172大豆叶和根的电导率测定
【具体实施方式】
[0041] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 下述实施例中所用引物均由H博生物公司合成。
[0044] 大豆科丰 1 号（Glycine max L. Merr. Kefengl)记载在 W. K. Zhang, Y. J. Wang, G. Z. Luo, J. S. Zhang, C. Y. He, X. L. Wu, J. Y. Gai, S. Y. Chen, QTL mapping of ten agronomic traits on the soybean (Glycine max L Merr.) genetic map and their association with EST markers, Hieor. Appl. Genet, 2004, 108:1131-1139 中，公众可W从中国科学院遗 传与发育生物学研究所获得；
[004引植物双元表达载体pBin438:公众可W从中国科学院微生物研究所方荣祥院±实 验室获得；参考文献：李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中 国科学（辑），1994, 24 (3) : 276-282。
[0046] 发根农杆菌 K599 记载在 Attila Kereszt, et al. , Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, Nature Protocols, 2007, 2(4),549-552)中，公众可从化ter M Gressnon教授，The University of 如eensland, St Lucia,如eensland4072, Australia,获得，或经 F*eter M Gressnon 教授同 意（书面同意书）后由中科院遗传与发育生物学研究所获得。
[0047] 实施例1、大豆miR172的克隆及其对非生物胁迫的应答
[0048] 1、大豆miR172的克隆
[0049] 通过RNA-Seq测序分析获得了大豆中的部分miRNA序列及其祀基因，建立了大豆 miRNA库。通过Realtime-PCR检测数个miRNA在大豆科丰1号的根、茎、叶、花、果实等不 同器官的表达模式及在不同胁迫处理下的受诱导情况。Realtime-PCR实验结果表明其中 miR172在根、茎、叶、花和果实中均有表达，其中在根部和茎部表达量较高（图1)。miR172 在150mM化Cl和空气干燥处理下均受到诱导（图2)。因此对miR172作进一步功能鉴定。
[0050] 根据大豆miRNA数据库，获得pre-miR172序列，设计引物，在大豆科丰1号的基因 组DNA中扩增得到miRNA的前体pre-miR172,具体如下：
[0051] 提取科丰1幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成CDNA作为模板，用如下扩 增引物进行PCR扩增：
[0052] Pre-miR172-up ;5, -CGCGGATCCTTAACAGTCGTTATTTGCGGATGTA(序列 3);
[0053] Pre-miR172-dp ;5, -CGGGGTACCGTGAAGTCGTTTATGGCTGATGCA(序列 4)
[0054] 得到约159bpPCR产物。经过测序，该PCR产物为159bp，具有序列表中序列1所示 的核巧酸，该核巧酸所示为pre-miR172的编码核酸分子，编码pre-miR172,该RNA的核巧酸 序列为序列表中序列2, pre-miR172经过剪切得到的miR172,其核巧酸序列为序列3。
[00巧]2、逆境胁迫处理下大豆miR172的表达特征
[0056] 将大豆科丰1种子种在盆中，生长2个星期后取幼苗分别进行盐和渗透胁迫处 理。盐胁迫处理为在歴石中加入150mM化Cl,干旱处理为将豆苗根部小必的吸去水分，置 于滤纸上暴露