马铃薯stu-miR9471及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明专利涉及一种microRNA(miRNA)及其应用，具体地说是马铃薯stu_miR9471及其应用。
【背景技术】
[0002]miRNA是一类非编码的单链小分子RNA，长约20 nt的内源性非蛋白编码RNAt3HiiRNA基因最初转录产生具有莖环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定革E基因的mRNA结合，通常在转录后水平引起mRNA降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用。
[0003]干旱胁迫是最主要的非生物胁迫之一，其对农作物的生长发育和产量造成极其严重的影响。据统计，地球上总土地面积的36%属于缺水的干旱或半干早区域，我国干旱和半干早区域大约占国土地面积的1/2。即使在半湿润和湿润的农业主产区，也通常会受到季节性和周期性的旱灾侵袭。干旱胁迫对农作物产量、质量的影响相当于其余自然灾害之和，其危害性在各种自然逆境胁迫中占首位，仅次于病虫害对作物造成的损失。解决干旱问题的途径，除了节水灌溉来提高水分的利用效率之外，就是培育节水抗旱的新品种以提高作物自身抵御干旱的能力。要达到这一目的，必须了解作物响应干旱胁迫的分子机制。因此，对作物抗旱机理的研究以探索提高作物抗旱能力是各国科学家关注的研究热点问题。尤其是近年来对拟南芥、水稻等模式植物的深入研究，已鉴定、克隆出大量耐旱相关的基因，已研究清楚了一些耐盐相关的基因的调控模式。将抗旱、耐盐基因通过基因工程的手段整合到目标植物基因组中或有目的的抑制或诱导一些干旱相关基因的表达来获得转基因植株，开辟了培育高度抗旱性作物新品种的新途径。随着对植物抗旱机理的了解以及转基因技术的日趋成熟，利用转基因技术来获得抗旱的育种材料或遗传改良的新品种，已成为抗旱品种培育最具发展潜力的方向。
[0004]谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是一种在植物中普遍存在并参与多种细胞活动的功能蛋白，具有参与植物次生代谢、解毒以及免受氧化损伤等重要作用。前人的的研究表明植物GSTs基因在植物响应干旱、脱水、高盐、冷害、辐射以及ABA等胁迫中发挥着重要的作用。例如，George等(2010)利用耐干旱的棻荑牧豆树作为模式植物体系开发非生物胁迫耐受相关基因的功能。通过构建棻荑牧豆树叶片cDNA文库，鉴定出三个由生长素诱导的谷胱甘肽转移酶。其中PjGSTUl被定位于线粒体的GST基因之一，并可以提高转基因烟草干旱耐受能力。转PjGSTUl基因的烟草株系在15% PEG胁迫下与非转基因烟草相比起生长状态良好。GFP融合载体表明PjGSTUl蛋白也被定位于转基因烟草的线粒体中表达。PjGSTUl的过氧化物酶活性和定位于线粒体表明该基因对于活性氧起清除作用。GSTs可以清除植物在干旱胁迫下产生的过量的活性氧，进而提高植物的干旱耐受能力。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供马铃薯stu-miR9471的前体序列、stu-miR9471调节靶基因表达以研究靶基因功能的应用、stu-miR9471调节靶基因表达提高植物抗旱能力，培育抗旱植物品种的应用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
马铃薯stu-miR9471的前体序列如下(本发明中所列核苷酸序列均为5,—3'):uggucacucaacuauuauuaucuuagaaagucgucuuucuucuugauucagauuuuuucaacaaagaaauugacuuucugauauaauaacuguuuaguugagugucgauaugag(序列表SEQ ID NO: I) 0
[0007]马铃薯stu_miR9471的前体序列的二级结构式为:自5'端7bp_9bp和67bp_69bp形成环状，自5'端19bp_22bp和55bp_57bp形成环状，自5'端27bp_29bp和47bp_50bp形成环状，自5'端32bp-44bp形成环状;其他碱基配对形成茎环结构。
[0008]编码上述马铃薯stuiiR9471的前体序列的DNA序列为:tggtcactcaactattattatcttagaaagtcgtctttcttcttgattcagattttttcaacaaagaaattgactttctgatataataactgtttagttgagtgtcgatatgag(序列表SEQ ID NO:2)。
[0009]上述马铃薯stu_miR9471的成熟序列如下:acuuucugauauaauaacu(序列表SEQ IDNO: 3)。8加-1^1?9471的成熟序列是前体序列自5'端32bp_52bp的一段RNA序列。
[0010]上述马铃薯stu_miR9471的前体序列在研究基因功能中的应用，stu_miR9471特异性抑制靶基因谷胱甘肽S-转移酶(PGSC0003DMG401008955)的表达(降解靶基因mRNA)，所述谷胱甘肽S-转移酶基因序列如序列表SEQ ID NO:4所示。
[0011]上述马铃薯stu-miR9471的前体序列在培育抗旱转基因植物中的应用。
[0012]优选地，所述转基因植物为马铃薯(Solanum tuberosum)0
[0013]优选地，在马铃薯中过表达SEQ ID NO:1所述miRNA，或者抑制SEQ ID NO:1所述miRNA的表达，培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯。
[0014]采用上述技术方案所产生的技术效果在于:本发明提供了一种马铃薯Stu-miR9471及其应用。RLMHACE测检结果表明stu-miR9471调控谷胱甘肽S-转移酶(PGSC0003DMG401008955)，可用于研究该谷胱甘肽S-转移酶基因的功能，即通过过表达或缺失表达该谷胱甘肽S-转移酶时研究植物的生理生化变化。荧光定量PCR测检结果表明，stu-miR9471的表达受干旱胁迫调控，说明其在马铃薯适应干旱胁迫中起着重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯，对提高马铃薯产量具有重要意义。
【附图说明】
[0015]图1是本发明马铃薯stu-miR9471的二级结构图。
[0016]图2是本发明马铃薯靶基因降解电泳图。
[0017]图3是本发明马铃薯靶基因降解组测序图。
[0018]图4是本发明马铃薯stu-miR9471的荧光定量PCR图。
【具体实施方式】
[0019]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对【具体实施方式】进行详细说明。本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
[0020]在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，以下实施例仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。并且，本发明所使用的各种原料以及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得;所有定量试验均设置三次重复试验，结果取平均值。
[0021]实施例一:stu-miR9471和靶基因序列的确认
马铃薯stu-miR9471的前体序列如下:uggucacucaacuauuauuaucuuagaaagucgucuuucuucuugauuc
agauuuuuucaacaaagaaauugacuuucugauauaauaacuguuuaguugagugucgauaugag (序列表SEQ ID NO:1)。
[0022]如附图1所示，马铃薯stu-miR9471的前体序列的二级结构式为:自5'端7bp_9bp和67bp_69bp形成环状，自 5'端 19bp_22bp和55bp_57bp形成环状，自 5'端27bp_29bp和47bp-50bp形成环状，自5'端32bp-44bp形成环状;其他碱基配对形成茎环结构。
[0023]编码上述马铃薯stuiiR9471的前体序列的DNA序列为:tggtcactcaactattattatcttagaaagtcgtctttcttcttgattcagattttttcaacaaagaaattgactttctgatataataactgtttagttgagtgtcgatatgag(序列表SEQ ID NO:2)。
[0024]上述马铃薯stu_miR9471的成熟序列如下:acuuucugauauaauaacu(序列表SEQ IDNO: 3)。8加-1^1?9471的成熟序列是前体序列自5'端32bp_52bp的一段RNA序列。
[0025]上述马铃薯stu-miR9471的前体序列在研究基因功能中的应用，stu-miR9471抑制靶基因谷胱