果胶裂解酶优化基因及其表达载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及果胶裂解酶基因，尤其设及经过优化后的果胶裂解酶基因W及含有优 化基因的重组表达载体和重组宿主细胞，还设及它们在制备果胶裂解酶中的应用，属于果 胶裂解酶领域。
【背景技术】
[0002] 果胶裂解酶(pectin lyase,EC 4.2.2.10)能够特异地催化高醋化度果胶降解。通 过反式消去方式在果胶C-4位置处断裂糖巧键，同时从C-5处消去一个氨原子，生成含不饱 和键的产物。果胶裂解酶是果胶酶中唯一一种能够降解高醋化度果胶且不产生甲醇的酶 类，根据酶作用底物环境的酸碱性，可分为酸性果胶裂解酶和碱性果胶裂解酶两类。其广泛 地应用于食品工业、纺织工业、造纸业、含果胶类物质的污水处理等（Y a d a V，S . e t al.Pectin lyase:A review.Proc Biochem,2009,44(1),1-10.)。
[0003] 果汁中含有丰富的维生素、酸分和无机盐等人体所必须的营养物质。随着人们对 健康饮食的注重，果汁受到人们的喜爱，果汁市场规模不断地扩大。但是在果汁生产中，由 于水果富含大量的果胶和纤维素等物质，经压棒后的果浆非常粘稠，导致果汁的压棒率低 且所得果汁难W澄清，是阻碍果汁生产的一大难题。传统工艺中的处理方法不仅耗费人力 财力，而且易造成高能耗、二次污染等问题。近年来人们通过使用酶处理法，添加果胶酶来 解决果汁生产中的问题。在果汁生产过程中添加果胶酶能够有效的降低果浆粘稠度，果汁 的产量会大幅增加，比传统的机械方法相比不仅所得果汁产量增加，果汁的感官得到改善 而且更多水果中的营养物质得W保留。果胶裂解酶作为果胶酶的一种也被应用在果汁的生 产中。将真菌化nicillium e邱ansum F16来源的果胶裂解酶纯化后，用来处理苹果汁、葡萄 汁等，其能够有效地澄清运些果汁，提高果汁光穿透率，并对其处理的果汁进行甲醇检测， 没有测到甲醇等有害物质的存在。
[0004] 在纺织业中所用的果胶裂解酶为碱性果胶酶，主要用于棉麻纺织品的脱胶。传统 碱法处理过程中产生的废水中含有高COD、高B0D、高抑、高盐分等，产生高能耗、二次污染等 不利因素，但经酶处理所得的纺织品往往能够避免运些缺陷，且其产品吸水率高、易染色、 手感更好。有报道用果胶酸裂解酶来处理棉纤维，并对酶处理后的棉纤维的物理化学性质 做了研究，所得纤维可湿润性强、洁白度更好、结晶度指数高、易染色，其优于碱处理所得纤 维。
[0005] 在饲料中果胶裂解酶也被使用，非淀粉多糖是由果胶、纤维素、半纤维素和抗性淀 粉等组成的，在动物饲料中存在许多的非淀粉多糖。非淀粉多糖是一种抗营养因子，影响肠 胃内消化酶的活性，不利于肠胃对营养成分的吸收和利用。单胃动物，自身缺乏降解非淀粉 多糖的酶系，故而不能够利用运些物质，就会造成动物食欲不佳等状态。果胶裂解酶能够降 解运些非淀粉多糖，酶解得到的产物，能够作为其他酶的反应底物，从而促进动物肠胃对饲 料的消化吸收。目前，主要将果胶酶与其他酶类配成复合酶用于饲料中，来提高动物对饲料 的利用率，提高其生产性能。
[0006] 果胶裂解酶也用于果胶低聚糖的生产，果胶低聚糖(POS)主要指由2~20个半乳糖 醒酸通过Q-I，4糖巧键相连接组成的一种功能性低聚糖，部分半乳糖醒酸被甲基化。果胶低 聚糖能够促进肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌的生长，有效抑制肠道内病原菌的增 殖，从而调节肠道内微生态菌群的动态平衡;可W促进肠道蠕动，增加对微量元素的吸收， 提高机体的免疫功能。用酶处理法来生产果胶低聚糖，不需要添加其他化学试剂，不会有副 反应的发生。果胶低聚糖主要通过果胶裂解酶和聚半乳糖醒酸酶降解果胶来生成。
[0007] 天然果胶裂解酶普遍存在于植物和微生物中，来自植物的果胶酶产量低且不易进 行大规模的生产，而微生物因具有生长速度快、营养要求低、易于大规模培养等诸多优点成 为果胶酶的主要来源。有许多微生物来源的果胶裂解酶已经被报道，其中真菌来源的较多， 如来源于曲霉、青霉等，细菌来源的果胶酶也有不少报道。目前，国内果胶裂解酶的生产主 要是用产果胶裂解酶的菌株进行固态发酵，但其产量往往不高、酶活力低下且不易于保存。 效价比较高的果胶酶仍然依赖于国外进口，但进口酶的价格昂贵，使企业的生产成本增加。 随着中国食品工业的不断发展，对酸性果胶酶的需求量不断增加。对于产量高、稳定性好、 专一性强、酶活力高的果胶酶制剂是市场所要求的。
[000引随着分子生物学技术的深入研究，利用一些高效微生物菌种来生产性质优良的果 胶裂解酶已经成为一种新的途径。国内外研究者已经从不同微生物中筛选出许多具有优良 性质的果胶裂解酶基因，运些果胶裂解酶性质各异，如高比活、耐热、耐低溫等。为了提高运 些酶的表达量与纯度，有研究者将运些果胶裂解酶基因在大肠杆菌、毕赤酵母等宿主菌中 进行异源重组表达。强慧妮等利用RT-PCR技术从黑曲霉化IM-6)中扩增得到去除信号肤的 果胶裂解酶基因A，将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上，构建重组表达质粒PPIC9K-pelA，电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度1.5%的甲醇对其进 行诱导，将发酵上清液浓缩后，用盐酸法测定其酶活可W达到2.3U/mL(Qiang，H.et al.Expression of a pectin lyase A gene from Aspergillus niger in Pichia pastoris GS115.Chinese journal of biotechnology,2009,25(12),1962)0Claudio P有 rez-Fuentes等将来源于青霉的果胶多核巧酸裂解酶基因克隆，将其插入表达载体pPICZA 上，构建表达质粒转化酵母GS115,得到两株表达量高的菌株，用盐酸法测得的酶活分别为 1.07U/mL和1.16U/mL(P有rez-Fuentes,C.et al.Heterologous expression of a Penici Ilium purpurogenum pectin lyase in Pichia pastoris and its CharacterizationJungal Biology ,2014,118(5-6) ,507-515.)。但运些报道中关于酸性 果胶裂解酶的很少，且其表达量不高，纯化回收率低，导致其不能被广泛应用。
[0009]通常提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达有密码子优化、mRNA结构改造、GC含 量调整等策略。其中，优化外源基因的密码子是主要的手段(憂东宋，梁宋平.外源蛋白在己 氏毕赤酵母中高效表达的策略，吉首大学学报.2001,22,（3) ,40-44)。研究发现物种具有密 码子偏爱性，即不同物种对密码子的使用频率是不同的，有些密码子甚至从来不使用，那些 不经常使用甚至从不使用的密码子称为稀有密码子或非偏爱型密码子。非偏爱型密码子形 成的原因主要是细胞内缺乏识别运些密码子的tRNA。对于不同的表达系统如毕赤酵母和大 肠杆菌，其密码子偏好性是不同的。若外源基因含有较多的宿主菌非偏爱型密码子，尤其是 连续出现的话，将会严重影响其在宿主菌中的表达量。为了消除稀有密码子对蛋白表达量 的影响，可采用对异源基因的密码子进行优化来实现，即在不改变外源基因氨基酸序列的 情况下，将外源基因中的稀有密码子替换为宿主常用的密码子。不同来源的酶蛋白外源基 因经密码子优化后其在毕赤酵母中的表达量提高程度差别很大，例如:Teng等通过优化护 1,3-1，4葡聚糖酶的密码子组成，使其在毕赤酵母中的表达量提高10倍(Teng D，et al.， Codon optimization of Bacillus Iicheniformis beta-l，3-1，4-glucanase gene and its expression in Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74:1074-1083) ;Chang将来源于假丝酵母的脂肪酶密码子进行优化后，在毕赤酵母中的表达量提高 4.6倍（Chang S胖，et al,Codon optimization of Candida rugosa Iiplgene for improving expression in Pichia pastoris and