利用肌联蛋白多态性检测强直性脊柱炎易感性的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，具体涉及一种检测强直性脊柱炎易感性的试剂盒。
【背景技术】
[0002]强直性脊柱炎又名别赫捷列夫氏(VonBechterev)病或马-施二氏(Maritstrumpel I)病，是一种慢性、进行性，中轴关节受累的慢性炎症性疾病。主要影响骨盆的骶髂关节、脊柱关节和椎旁组织。主要症状为下腰痛、脊椎僵硬及运动范围受限、X线显示两侧骶髂关节炎(sacroilitis)为其特征。由于该病一般先侵犯骶髂关节，并重点累及脊柱，最终导致脊柱骨性强直，故目前国内外多称之为强直性脊柱炎(AnkglosingSpondytitis,AS)。
[0003]强直性脊柱炎有明显的种族性，在不同民族中发病率的差异很大。印第安人发病率最高，北美印第安人发病率为2.7 %?6.3%。其次为白种人，白种人中发病率为0.1 %?1.4%。黄种人低于白种人，我国约为0.3%。而黑人发病率最低，约为白人的1/4，在非洲仅为 0.2%。
[0004]强直性脊柱炎好发于20至40岁的成年人，尤其是20?30岁的青年男性。
[0005]强直性脊柱炎呈常染色体显性遗传，有明显的家族遗传倾向，遗传因素>90%。据调查，强直性脊柱炎病人亲属发病率比一般人高一倍左右，同胞复发风险比为82.90%以上的AS病人具有HLA-B27阳性，在正常人群中阳性率为8 % ;子女HLA-B27阳性占50 %，发生强直性脊柱炎的占25%。目前基本上已有定论，HLA-B27作为独立的致病基因在AS的发病中起作用。因为在HLA-B27阳性个体中只有I %?5 %发展成为AS，提示还有其他基因参与AS的发病。
[0006]TTN全称肌联蛋白，它是骨骼肌纤维中第三类丰富蛋白质，源自M线，并沿肌球蛋白纤维伸展，通过肌节的A带，最后到达Z线。肌联蛋白是高度弹性的分子(伸展时比原长度多出3μπι)，因此在肌收缩和舒张时保持肌球蛋白纤维位于肌节的中心。肌联蛋白通过将微管之间相连从而使得两个肌小节之间达到完美的力平衡。它是一个巨大的肌小节蛋白，具有复杂的、分子折叠的功能。目前在临床上，肌联蛋白抗体(Titin-ab)可以用来诊断胸腺瘤重症肌无力(MGT)。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种利用肌联蛋白(TTN)多态性检测强直性脊柱炎易感性的试剂盒。本发明通过利用基因型对强直性脊柱炎易感性进行检测，为辅助诊断(尤其是早期诊断)强直性脊柱炎和治疗强直性脊柱炎提供基础。
[0008]本发明的第一方面，提供了一种对个体的强直性脊柱炎易感性检测的方法，包括步骤:
检测该个体的TTN基因、转录本和/或蛋白，并与正常的TTN基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群。
[0009]在一优选例中，所述的方法中检测的是TTN的基因或转录本，并与正常TTN核苷酸序列比较差异。
[0010]在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性(SNP):
第1001位A—G;其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0.1。
[0011]在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在TTN基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤:
1)用TTN基因特异性引物扩增样品的TTN基因，得到扩增产物；
2)检测扩增产物中是否存在以下的单核苷酸多态性:
第1001位A—G;其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0.1。
[0012]在一优选例中，所述TTN基因特异性引物具有SEQID N0.2和3的序列。
[0013]在一优选例中，所述扩增产物的长度为100-2000bp，且含有SEQ IDN0.1中第1001位。
[0014]在本发明的第三方面，提供了一种利用肌联蛋白(TTN)多态性检测强直性脊柱炎易感性(利用基因型检测强直性脊柱炎)的试剂盒，其包括:特异性扩增TTN基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ ID N0.1中第1001位的扩增产物。
[0015]在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂:
1)与SEQID N0.1中第1001位的突变结合的探针；
2)识别SEQID N0.1中第1001位的突变限制性内切酶。
[0016]在另一优选例中，所述的突变选自以下的单核苷酸多态性:
第1001位A—G;其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0.1。
[0017]所述引物的序列，可如SEQ ID N0.2和3所示。
[0018]所述扩增产物的长度为100-2000bp且含有SEQ ID N0.1中第1001位。
[0019]所述试剂盒还包括:Taq酶、dNTPs、镁离子、常规的PCR反应缓冲液。
[0020]本发明经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。发现和证明了 TTN的基因组序列与强直性脊柱炎密切相关，其中关联研究结果显示，在TTN基因的SEQ ID N0.1中第1001位的SNP(第1001位A—G)在对照组和病例组中的分布存在显著性差异(P<0.05)，因此，可作为辅助性检测强直性脊柱炎(或其易感性)的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。
[0021]具体而言，本发明揭示了TTN基因一种单核苷酸多态性(SNP)以及该多态性与强直性脊柱炎的相关性。本发明的SNP是SEQ ID N0.1所示序列的第1001位的G/A多态，等位基因型A在强直性脊柱炎病人群中的频率，要高于在正常对照人群中的频率。
[0022]基于本发明的新发现，本发明还提供TTN蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括:制备用于辅助性诊断强直性脊柱炎的药物或试剂。
[0023]另一方面，本发明还包括对人TTN基因DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人TTN基因产物或片段。较佳地，指那些能与人TTN基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人TTN蛋白的分子，也包括那些并不影响人TTN蛋白功能的抗体。
[0024]本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fal/或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体。
[0025]本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人TTN基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人TTN蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括弗氏佐剂等。
[0026]本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人TTN蛋白功能的抗体以及不影响人TTN蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人TTN基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人TTN基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生;与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
[0027]抗人TTN蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人TTN蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗TTN抗体是不识别正常TTN但识别突变TTN的抗体，或者识别正常TTN但不识别突变TTN的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的强直性脊柱炎易感性检测。
[0028]利用本发明TTN蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与TTN蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
[0029]本发明还涉及定量和定位检测人TTN蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括ELISA等。
[0030]—种检测检测样品中是否存在TTN蛋白的方法是利用TTN蛋白的特异性抗体进行检测，它包括:将样品与TTN蛋白特异性抗体接触;观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在TTN蛋白。
[0031]TTN蛋白的多聚核苷酸可用于TTN蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面，TTN蛋白的多聚核苷酸可用于检测TTN蛋白的表达与否或在疾病状态下TTN蛋白的异常表达。如TTN基因DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断TTN蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用TTN蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测TTN蛋白的转录产物。
[0032]检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA13TTN蛋白突变的形式包括与正常野生型TTN基因DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
[0033]最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用TTN基因特异性引物扩增样品的TTN基因，得到扩增产物;然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性:第1001位A—G，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0.1。
[0034]应理解，在本发明揭示了TTN基因的SNP与强直性脊柱炎的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在第1001位A—G。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5'端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。