一种硫酸软骨素聚电解质纳米粒的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种高得率以及高生物利用度硫酸软骨素聚电解质纳米粒的制备方法，属于硫酸软骨素领域。
【背景技术】
[0002]硫酸软骨素是从猪、牛、鸡和鳘鱼的软骨中提取的一种由D-葡萄糖酸酸和N-乙醜-D-半乳糖胺组成的酸性粘多糖，常温下为白色粉末，无臭，无味，吸水性强，易溶于水而成粘度大的溶液，遇较高温度或酸即不稳定。它具有抗凝血和抗血栓作用，临床用于治疗冠状动脉硬化、血脂和胆固醇增高、心绞痛、神经痛、心肌缺血和心肌梗塞等症。
[0003]目前，国内外硫酸软骨素的提取多来自猪软骨、猪喉骨、鸡胸软骨；牛或羊鼻骨、喉骨、软肋、气管、月牙骨以及各部位的杂软骨;鱼软骨、蛋壳膜等。硫酸软骨素主要利用动物提取法和发酵法进行提取制备。
[0004]普通软骨素产品存在分子量波动大、口服吸收差、生物利用度低、疗效不稳定等缺点。有实验表明，中低分子量的硫酸软骨素产品的体内吸收均明显优于普通分子量的产品，分子量越小吸收率越高。硫酸软骨素的生物活性随分子量不同而各异，其药理活性与分子量有着密切的关系。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题:针对目前普通软骨素产品存在分子量波动大、口服吸收差、生物利用度低、疗效不稳定，而且提取的硫酸软骨素收率不高、质量不稳等问题，提供了一种高得率以及高生物利用度硫酸软骨素聚电解质纳米粒的制备方法，本发明先将鸡软骨进行酶解去除表面的杂蛋白，再碱溶、醇沉得硫酸软骨素，加入壳聚糖后硫酸软骨素采用聚电解质复合法制备聚电解质纳米粒，本发明制备得到的聚电解质纳米粒生物相容性好、分子量小、口服吸收效果好、生物利用率高，而且该方法操作简单，壳聚糖和硫酸软骨素室温条件下即可在水相内完成聚电解质纳米粒的制备，硫酸软骨素质量好，收率高，在制备中加入冻干保护剂，不仅可以提高电解质纳米粒的溶解性和稳定性，而且可以控制其纳米粒径不易变大、从而进一步提尚稳定性。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)称取I?2kg鸡软骨用去离子水冲洗3?5遍，用刀切除钙化的部分，洗净后将鸡软骨放入陶瓷酶解罐中，按料液比1: 5向罐中加入相应体积的蒸馏水，得酶解底物，用浓度为
0.5mol/L乙酸溶液调节pH至1.5?2.5 ；
(2)当pH调至预设值时，加入酶解底物总质量0.5?0.7%的胃蛋白酶，搅拌均匀后移入恒温箱，在30?40°C下保温酶解7?9h，过滤分离得到酶解去除杂蛋白后的鸡软骨，放入烘箱中在105?110 °C下干燥I?2h，再经研钵研磨后过40目标准筛，得到去杂鸡软骨素；
(3)将上述得到的去杂鸡软骨素按料液比1:6和质量浓度为10%氢氧化钠溶液进行混合，移入40?45°C水浴锅中，保温浸提5?6h后用卧式离心机以4000?5000r/min离心20?30min，分离去除下层沉淀得到上清液；
(4)用浓度为0.3moI/L盐酸调节上述上清液pH至5.5?6.5，加入上清液总体积I/20的质量浓度为4%乙酸钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀后再加入混合液总体积2/3的无水乙醇，放入超声振荡仪以200?300W功率超声振荡反应I?2h后移入4?6°C的冰水浴中，静置沉淀过夜，经高速离心机离心分离后干燥，得到硫酸软骨素；
(5)称取10?20g壳聚糖溶于500?100mL质量浓度为10%醋酸溶液中，得壳聚糖溶液，再称取10?20g上述制得的硫酸软骨素，溶于500?100mL蒸馏水，配制得硫酸软骨素溶液；
(6)将上述制得的硫酸软骨素溶液逐滴滴入以600?700r/min转速搅拌中的壳聚糖醋酸溶液中，控制滴加速度使其15?20min内滴加完毕，继续搅拌5?1min形成均一的混悬液；
(7)向上述混悬液中加入其体积1/10葡萄糖和海藻酸钠混合液作为保护剂，所述混合液中葡萄糖质量占10%，海藻酸钠质量占5%，放入高剪切分散机中分散均匀，再经真空冻干机于-40?-30°C下冻干后粉碎并过200目标准筛，即得高得率以及高生物利用度硫酸软骨素聚电解质纳米粒。
[0007]本发明的应用的方法:分别配制180?200mL的模拟人工胃液和120?150mL pH4.0的磷酸盐缓冲液作为透析介质分别置于锥形瓶中备用，取0.3?0.Sg本发明制备的聚电解质纳米粒取置于截留分子量为10000的透析袋中，分别将装有载药聚电解质纳米粒的透析袋置于盛有人工胃液和磷酸盐缓冲液的透析介质锥形瓶中，采用恒温振荡水浴法，在35?37°C温度和130?150r/min振荡频率条件下，振荡10?12h，每隔Ih取透析外液3?5mL，采用紫外分光光度法进行测量，计算累计释放率，3.5h后达到75%以上释放率，24h释放率可达到95%以上。
[0008]本发明的有益效果是:
(1)本发明制备得到的聚电解质纳米粒生物相容性好、分子量小、口服吸收效果好、生物利用率高；
(2)本发明操作方法简单，壳聚糖和硫酸软骨素在室温条件下即可在水相内完成聚电解质纳米粒的制备，发展前景广阔，在制备中加入冻干保护剂，不仅可以提高电解质纳米粒的溶解性和稳定性，而且可以控制其纳米粒径不易变大。
【具体实施方式】
[0009]称取I?2kg鸡软骨用去离子水冲洗3?5遍，用刀切除钙化的部分，洗净后将鸡软骨放入陶瓷酶解罐中，按料液比1:5向罐中加入相应体积的蒸馏水，得酶解底物，用浓度为0.5mol/L乙酸溶液调节pH至1.5?2.5 ；当pH调至预设值时，加入酶解底物总质量0.5?0.7%的胃蛋白酶，搅拌均匀后移入恒温箱，在30?40°C下保温酶解7?9h，过滤分离得到酶解去除杂蛋白后的鸡软骨，放入烘箱中在105?110 °C下干燥I?2h，再经研钵研磨后过40目标准筛，得到去杂鸡软骨素;将上述得到的去杂鸡软骨素按料液比1:6和质量浓度为10%氢氧化钠溶液进行混合，移入40?45°C水浴锅中，保温浸提5?6h后用卧式离心机以4000?5000r/min离心20?30min，分离去除下层沉淀得到上清液；用浓度为0.3mol/L盐酸调节上述上清液pH至5.5?6.5，加入上清液总体积1/20的质量浓度为4%乙酸钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀后再加入混合液总体积2/3的无水乙醇，放入超声振荡仪以200?300W功率超声振荡反应I?2h后移入4?6°C的冰水浴中，静置沉淀过夜，经高速离心机离心分离后干燥，得到硫酸软骨素;称取10?20g壳聚糖溶于500?100mL质量浓度为10%醋酸溶液中，得壳聚糖溶液，再称取10?20g上述制得的硫酸软骨素，溶于500?100mL蒸馏水，配制得硫酸软骨素溶液;将上述制得的硫酸软骨素溶液逐滴滴入以600?700r/min转速搅拌中的壳聚糖醋酸溶液中，控制滴加速度使其15?20min内滴加完毕，继续搅拌5?1min形成均一的混悬液；向上述混悬液中加入其体积1/10葡萄糖和海藻酸钠混合液作为保护剂，所述混合液中葡萄糖质量占10%，海藻酸钠质量占5%，放入高剪切分散机中分散均匀，再经真空冻干机于-40?-30 0C下冻干后粉碎并过200目标准筛，即得高得率以及高生物利用度硫酸软骨素聚电解质纳米粒。
[0010]实例 I
称取Ikg鸡软骨用去离子水冲洗3遍，用刀切除钙化的部分，洗净后将鸡软骨放入陶瓷酶解罐中，按料液比1: 5向罐中加入相应体积的蒸馏水，得酶解底物，用浓度为0.5mo I/L乙酸溶液调节PH至1.5;当pH调至预设值时，加入酶解底物总质量0.5%的胃蛋白酶，搅拌均匀后移入恒温箱，在30°C下保温酶解7h，过滤分离得到酶解去除杂蛋白后的鸡软骨，放入烘箱中在105°C下干燥lh，再经研钵研磨后过40目标准筛，得到去杂鸡软骨素;将上述得到的去杂鸡软骨素按料液比1:6和质量浓度为10%氢氧化钠溶液进行混合，移入40°C水浴锅中，保温浸提5h后用卧式离心机以4000r/min离心20min，分离去除下层沉淀得到上清液；用浓度为0.3mol/L盐酸调节上述上清液pH至5.5，加入上清液总体积1/20的质量浓度为4%乙酸钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀后再加入混合液总体积2/3的无水乙醇，放入超声振荡仪以200W功率超声振荡反应Ih后移入4°C的冰水浴中，静置沉淀过夜，经高速离心机离心分离后干燥，得到硫酸软骨素;称取1g壳聚糖溶于500mL质量浓度为10%醋酸溶液中，得壳聚糖溶液，再称取1g上述制得的硫酸软骨素，溶于500mL蒸馏水，配制得硫酸软骨素溶液;将上述制得的硫酸软骨素溶液逐滴滴入以600r/min转速搅拌中的壳聚糖醋酸溶液中，控制滴加速度使其15min内滴加完毕，继续搅拌5min形成均一的混悬液；向上述混悬液中加入其体积1/10葡萄糖和海藻酸钠混合液作为保护剂，所述混合液中葡萄糖质量占10%，海藻酸钠质量占5%，放入高剪