白介素-2融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及白介素-2融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提供了包含结合至 Bcl-2家族成员蛋白部分的白介素-2蛋白部分的融合蛋白。
【背景技术】
[0002] 白介素-2(化-2)是主要由激活CD4+T细胞产生的多效性细胞因子，其在产生正常 免疫应答中发挥关键的作用。化-2促进激活T淋己细胞的增殖和扩大培养、增强B细胞生长、 并且激活单核细胞和天然杀手细胞。
[0003] IL-2是协同表达的IL-2受体a (IL-2Ra或者CD25 ;也称为"Tac"抗原）、IL-2受体0 (比-2祕或者CD122) W及白介素-2受体丫（比-2R 丫或者CD132;共有丫链）的配体。
[0004] 比-2Ra W约IQ-8M的Kd与化-2结合，并且也称为"低亲和力"的比-2受体；化-2与仅 表达IL-2Ra的细胞的结合没有导致任何可检测的生物学反应。
[0005] 大多数细胞例如静息T细胞对IL-2是不敏感的，因为它们仅表达IL-2郎和IL-2R 丫。抗原受体介导T细胞激活后，化-2Ra迅速表达。一旦IL-2Ra结合IL-2,其然后依次与IL-2祕和IL-2R 丫配合，导致信号转导和IL-2介导的生长刺激。
[0006] 重组人化-2( Proleukin形，阿地白介素）被允许当作免疫疗法来治疗转移性黑色 素瘤和转移性肾癌。Proleukin液被用于治疗癌症已超过15年，并且已经表明在患有转移性 黑色素瘤或者肾癌的患者中具有约15 %的完全或者部分反应比例。但是，Prole址in造成引 起肺部水肿和肝损伤的副作用。
[0007] Ontak饭（地尼白介素 (deniIeukin diftitox))是一种由作为勒!向配体的IL-2和 作为细胞杀灭载荷的修饰细菌毒素组成的融合蛋白，在美国被允许用于治疗皮肤T细胞淋 己瘤(CTCL)。尽管化tak被广泛认为是治疗CT化的有效药物，但是其具有重大的安全问题， 导致在美国的使用受到限制并且在美国之外没有得到许可。由于其在1999允许用于CT化， 在类风湿性关节炎、银屑病、肺癌和其他适应症中的试验已经表明化tak具有鼓舞人屯、的有 效迹象，但是因为严重的毒副作用的缘故而已经被放弃。因此，使用IL-2作为抗肿瘤剂已经 受到伴随用于肿瘤反应所需剂量的严重毒性的限制。
[000引环状排列山;[1^111曰1'17 permuted)的分子是线性分子(例如配体）的末端已经直接 或者经由接头连接在一起从而产生环状分子的那些分子，此后所述环状分子在另一个位置 打开从而产生新的带有不同于原先分子的末端的末端的线性分子。化-2的环状排列变体已 经在例如于2000年1月4日授权给化Stan等的美国专利No. 6，Ol 1，002中有描述。
[0009] 程序化细胞死亡或者"调亡"是一种在动物细胞发育中常见的现象，并且受到主动 调节和被动调节运两者调节。除了其参与淋己样系统发育和整个细胞群稳态之外，调亡还 在由调亡途径的异常调节引起的各种疾病和损伤中发挥重要的作用。相反，调亡的异常抑 制能够导致细胞的过度增殖，从而导致癌症和其他的过度增殖性素乱。
[0010] 调亡受到很多蛋白的调节，运些蛋白包括Bcl-2家族的成员。Bcl-2是被鉴定为调 节调亡的第一批蛋白之一（Cle ary 等，Cell 47:19-28，1986;Tsuji mo to 和 Croce, Proc.化tl .Acad. Sci .USA 83:5214-5218，1986)。由于它的发现，已经有若干个Bcl-2相关 蛋白（"8(：1-2家族蛋白"或者"8(31-2家族成员"）被鉴定为调亡的调节因子(胖11；[16,66]163 Dev. 10:1-15，1996;化ng等，细胞80:285-291，1995)。
[0011] 已经探索了用于治疗癌症等的若干种治疗性试剂，但是运些治疗性试剂表现出限 制了它们在临床中的应用的多种局限性。例如，很多化学治疗性试剂通过诱导正在增殖的 寶生性细胞中的调亡来发挥作用，但是它们的治疗价值受到它们对正常细胞具有毒性的程 度的限制。使用标准调亡抑制性分子例如肤类半脫氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)抑制剂 (例如DEVD类)进行的治疗已经证明由于运些抑制剂具有低的膜渗透性而无法满意地用于 临床工作。
[0012] 已经提出祀向免疫毒素(在有毒分子例如细菌毒素和通常衍生自抗体分子的祀向 域之间的遗传融合或者生物化学融合）W尝试选择性地消除癌症分子。例如，已经生成白喉 毒素(DT)变体并且测试了它们选择性地杀灭癌症细胞的能力(Tho巧e等，^^re 271:752-755，1978;Laske等，化Uire Medicine 3:1362-1368，1997)。类似地，已经研究了假单胞菌 (Pseudomonas)外毒素（PE)融合蛋白作为潜在的癌症疗法化reitman和化Stan,Blood 90: 252-259，1997; Shimamura等Cancer Res. 67:9903-9912; 2007)。已经在各种细胞类型中测 试了DT-BclxL融合蛋白阻断由星形抱菌素(S化urosporin)、丫射线福射和脊髓灰质炎病毒 诱导的调亡的能力(Youle等，Proc化tl Acad Sci.96:9563-9567)。粒细胞-巨隧细胞菌落 刺激因子BclxL(GM-CSF-BclxL)融合蛋白已经显示出加强人类单核细胞的增殖，并且保护 细胞W防发生诱导性细胞死亡(Youle等，JBC 282(15): 11246-11254)。
【发明内容】
[0013] 本发明设及白介素-2融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提供了包含结合至 Bcl-2家族成员蛋白部分的白介素-2蛋白部分的融合蛋白及其应用。
[0014] 在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素-2(化-2)和 Bcl-2家族多肤。在一些实施方式中，所述Bcl-2家族多肤可W是包含BH3域的促调亡Bcl-2 家族多肤（例如BacUBik/师4、81(1、81111/8〇(1、化4、834或者83^)。所述肌3域可^进一步包含 降低憐酸化的突变。包含进一步包含降低憐酸化的突变的BH3域的所述促调亡Bcl-2家族多 肤是Bad多肤。所述融合蛋白可能能够促进表达IL-2R的祀细胞的细胞死亡或者调亡、抑制 细胞存活、或者抑制细胞增殖。
[0015] 在一些实施方式中，所述Bcl-2家族多肤可W是抗调亡Bcl-2家族多肤（例如Bcl-Xl、Bc1-w或者Bcl-2)。所述融合蛋白可能能够抑制表达化-2R的祀细胞的细胞死亡和调亡、 促进细胞存活、或者促进细胞增殖。
[0016] 在一些实施方式中，所述IL-2可W是环状排列的（CP)。在一些实施方式中，所述 IL-2可W是对IL-2祕比对天然IL-2具有更高选择性的突变型IL-2,或者是对IL-2R 丫比对 天然IL-2具有更高选择性的突变型IL-2、或者破坏IL-2祕和IL-2R 丫之间的关联的突变型 比-2。
[0017] 在一些实施方式中，所述融合蛋白可W进一步包含接头。所述接头可W具有序列 GS或者是泛素或者泛素变体分子。
[0018] 在一些方面，提供了编码本文所述的融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分 子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
[0019] 在一些方面，提供了包含本文所述的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或 者包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞的药物组合物。
[0020] 在一些方面，提供了一种诱导细胞死亡的方法，所述方法通过如下方式来进行：向 需要的受试者施用包含促调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、 包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
[0021] 在一些方面，提供了一种诱导细胞死亡的方法，所述方法通过如下方式来进行:使 表达IL-2R的祀细胞与包含促调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
[0022] 在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行：向需要 的受试者施用包含促调亡Bcl-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含 所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
[0023] 在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行:使表达 比-2R的寶生性细胞与包含促调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
[0024] 在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行:使在肿 瘤微环境中表达IL-2R的非恶性细胞与包含促调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融 合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
[0025] 在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行:使表达 化-2R的免疫细胞与包含促调亡Bcl-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的载体接触。在一些实施方式中，所述免疫细胞是天然杀手细胞 并且所述融合蛋白是抗调亡Bd-2家族多肤。在一些另外可选的实施方式中，所述免疫细胞 是调节T细胞并且所述融合蛋白是促调亡Bd-2家族多肤。
[0026] 在一些方面，提供了一种治疗自身免疫性素乱的方法，所述方法通过如下方式来 进行：向需要的受试者施用包含促调亡Bcl-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核 酸分子、包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
[0027] 在一些方面，提供了一种刺激细胞增殖的方法，所述方法通过如下方式来进行：向 需要的受试者施用包含抗调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、 包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
[0028] 在一些方面，提供了一种刺激细胞增殖的方法，所述方法通过如下方式来进行:使 表达IL-2R的祀细胞与包含抗调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
[0029] 在一些方面，提供了一种增强免疫应答的方法，所述方法通过如下方式来进行：向 需要的受试者施用包含抗调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、 包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
[0030] 在一些方面，提供了一种增强免疫应答的方法，所述方法通过如下方式来进行:使 表达IL-2R的祀细胞与包含抗调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
[0031] 在一些方面，提供了一种繁殖或者扩大培养用于在过继性细胞转移疗法或者嵌合 抗原受体(CAR)疗法中使用的经改造的T细胞的方法，所述方法包括使所述经改造的T细胞 与根据本发明的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体 接触。
[0032] 在一些方面，提供了根据本发明的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者 包含所述核酸分子的载体用于在需要的受试者中或者细胞中诱导细胞死亡、治疗癌症、治 疗自身免疫性素乱、刺激细胞增殖、增强免疫应答、或者繁殖或扩大培养用于在过继性细胞 转移疗法或者嵌合抗原受体(CAR)疗法中使用的经改造的T细胞的应用。
[0033] 在另外可选的方面的各个实施方式中，所述受试者可W是人类。
[0034] 本
【发明内容】
部分不一定描述本发明的所有特征。
【附图说明】
[0035] 根据下文的其中参考附图的说明可W使本发明的运些和其他特征更加清楚，其 中：
[0036] 图1是PGW07大肠杆菌表达载体的展示图。
[0037] 图2A-B显示proS2-BAD的核酸序列(A)和氨基酸序列(B)。
【具体实施方式】
[0038] 本发明部分地提供了包括结合至Bcl-2家族蛋白的IL-2蛋白的融合蛋白及其应 用。
[0039] IL-2 蛋白
[0040] IL-2蛋白包括天然IL-2W及变体型IL-2蛋白。本文使用的"天然的"或"野生型" IL-2序列是指人类IL-2序列（例如，登录号为No. NP_000577.2)，不管是从天然来源纯化还 是使用重组技术制得。在一些实施方式中，野生型比-2序列包括Proleukin'取(阿地白介素） 序列：
[0041] PTSSSTKKT化QLEHL化DLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEE化NLAQSKNF HLRPWLISNINVIVLELKGWTTFMCEYADETATIVEFLNroHTFAQSIISTLT(SEQIDNO:l).
[0042] 在一些实施方式中，可W在本公开内容的所述融合蛋白中使用的IL-2蛋白是运样 的变体型11-2蛋白，该变体型11-2蛋白对IL-2地比对天然IL-2具有的选择性高，或者对IL-2R 丫比对天然IL-2具有的选择性高，或者破坏IL-2郎和IL-2R 丫之间的关联，如在例如WO 2012/088446 中所述。
[0043] 在一些实施方式中，可W在本公开内容的所述融合蛋白中使用的IL-2蛋白包括如 下氨基酸序列：
[0044] PTSSSTKKT化QLEHL化DLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEE化NLAgSKNF H^^PRDXXSNINVgVLELKG沈TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISl'LT(沈Q ID N0:2).
[0045] 在一些实施方式中，可W在本公开内容的所述融合蛋白中使用的IL-2蛋白包括如 下氨基酸序列：
[0046] PTSSSTKKT化QLEHL化DLQMILNGINNYKNPKLTRMLT^KFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEE化NLAgSKNF H哩P畑XXSNINVEVLELKG沈TTFMCEYADETATIVE化NWHT巧QSIISTLT(ProS2)(沈Q ID N0:2).
[0047] 在一些实施方式中，破坏IL-2祕和IL-2R 丫之间的关联的IL-2蛋白与野生型IL-2 相比包括如下取代：18R、2沈、8(^、810、85￥、861、891、93￥和1261';或者181?、226、745、801^、 811\85￥、861、891、92尸、93￥和1261';或者181?、226、80尸、810、85￥、86￥、891、92尸、93￥和1261'。
[0048] 在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的IL-2蛋白是环状排列 的（circularly permuted,CP)，如在例如于2000年1月4日授予化Stan等的美国专利No.6, Oll ,002中所述。
[0049] 在一些另外可选的实施方式中，可W在本公开内容的所述融合蛋白中使用的 cpIL-2蛋白包括如下蛋白：
[(K)加 ] MLT全KFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEEVLNLAgSKNFH哩P畑XXSNINVgVLELKG沈TTFMCEYADETATIV 邸LNRW口巧QSIISTLTGGNGGPTSSSTKKT化化邸化LDLQMILNGINNYKNPKLT(cpProS2)(SEQ ID N0：4).
[0051] 能够在本公开内容的融合蛋白中使用的例示性IL-2蛋白包括本文所述的那些IL-2蛋白，W及与天然的IL-2具有至少80%的序列同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至 少98%、或者甚至是至少99%的序列同一性的序列（"变体型IL-2蛋白"），只要所述变体型 IL-2蛋白保持结合IL-2受体的能力，或者对IL-2祕比对天然IL-2具有的选择性高，或者对 比-2R 丫比对天然比-2具有的选择性高，或者破坏如在WO 2012/088446或者Levin等Na化re 484:529-533,2012中所述的IL-2祕和IL-2R 丫之间的关联，或者保持所需要的生物活性。
[0052] 应当理解的是，根据本公开内容的IL-2蛋白包括可W比天然氨基酸IL-2蛋白短的 片段，只要IL-2蛋白片段保持结合IL-2受体的能力，或者保持对IL-2祕比对天然IL-2具有 高的选择性，或者保持对IL-2R 丫比对天然IL-2具有高的选择性，如在WO 2012/088446或者 Levin等化化re 484: 529-533,2012中所述，或者保持所需要的生物活性，不管是作为天然 序列的片段还是为其CP形式或者片段。
[0053] 还应当理解的是，本公开内容涵盖编码本文所述的或者本领域已知的IL-2蛋白的 核酸分子。
[0化4]例示性的IL-2核酸分子包括：
[0化5]
[0化7] B化-2家族蛋白
[0058] Bcl-2相关蛋白或者多肤（r'Bcl-2家族蛋白"或者"Bcl-2家族成员"）参与调亡的 调节。Bcl-2家族蛋白分为两个明显不同的类别：抑制细胞死亡的那些Bcl-2家族蛋白（"抗 调亡"Bcl-2家族蛋白）和促进细胞死亡的那些Bcl-2家族蛋白（"促调亡"Bcl-2家族蛋白）。 Bcl-2家族蛋白共同具有1至4个保守的Bc ^2同源(BH)域，它们称为Mll、B肥、B册和BH4。 [0化9]抗调亡 Bd-2家族蛋白包括 Bcl-2 本身、Bcl-XL(Boi