一种用于检测食品中细菌的探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及一种检测用的探针，具体涉及一种用于检测食品中细菌的探针和 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 食品细菌即指常在食品中存在的细菌，自然界的细菌种类繁多，但由于食品理化 性质，所处环境条件及加工处理等因素的限制，在食品中存在的细菌只是自然界细菌的一 小部分。食品细菌包括致病菌和非致病菌：致病菌是指随食物进入人体后可引起食源性疾 病，常见者如沙门氏菌、志贺氏菌等，与疾病直接有关，一般规定在食品中不允许检出。非致 病菌一般不引起人类疾病，但其中一部分为腐败菌，如假单胞菌，与食品变质有密切关系， 是评价食品卫生质量的重要指标。
[0003] 在我国的食品卫生标准中，测定食品中细菌数量的方法，是在严格规定的培养方 法和培养条件下进行的，使得适应这些条件的每一个活菌细胞能够生成一个肉眼可见的菌 落，所生成的菌落总数即是该食品中的细菌总数。食品中细菌的种类很多，它们的生理特性 和所需要的培养条件不尽相同。如果要采用培养的方法计数食品中所有的细菌种类和数 量，必须采用不同的培养基及培养条件，其工作量很大，通常会采用检测指标菌的方法来替 代。
[0004] 例如，肠道致病菌如沙门氏菌属和志贺氏菌属是引起食物中毒的重要致病菌，然 而这些致病菌往往数量较少且难以培养，对食品进行逐批逐件地检验又不可能，鉴于大肠 菌群与肠道致病菌来源相同，而且一般在外环境中生存时间也与主要肠道病原菌一致，所 以大肠菌群通常就作为肠道病原菌污染食品的指示菌。通过检测指标菌来大致判断食品中 的致病菌存在状况，不失为一种简便方法，但很显然，指标菌和病原菌的存在并非完成平行 的关系一一食品中检出大肠菌群，只能说明有肠道病原菌存在的可能性，食品中未检测大 肠菌群，也不能完全排除食品中可能有肠道病原体污染。
[0005] 由此可见，当前的食品细菌检测方法并不能很好地满足简便、快速、准确的检测需 求，对于难培养、难鉴定的食品源致病菌，需要更高效的检测手段。 【实用新型内容】
[0006] 本实用新型的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种探针，所述探 针能用于检测食品中细菌，通过荧光原位杂交的手段，本实用新型还提供了一种快速、灵 敏、特异性地检测食物中常见细菌的试剂盒和方法。
[0007] 为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于检测食品中细菌的探针，所述探针 呈分子信标结构，即探针序列由茎、环两部分组成，总长度25~60个碱基，其中中间的环序 列部分与细菌16srRNA或23srRNA序列相匹配，两端茎部分是5~8个互补的DNA或PNA 序列，探针在常温下会自动退火形成发夹结构；探针的5'端用荧光基团标记，3'端用荧光 淬灭基团标记，常态下游离的探针由于呈发夹结构，荧光基团因紧挨荧光淬灭基团，而不会 有荧光发出，只有当探针与靶序列成功杂交上之后，荧光基团和荧光淬灭基团分离开来，才 会发出荧光；
[0008] 所述探针是通过核酸杂交的原理检测食品中的细菌的，所述细菌包括食品中正常 携带的细菌以及食品被污染后带上的致病菌。
[0009] 优选地，所述探针5'端的荧光基团为FITC、FAM和Cy3中的一种，所述探针3'端 的荧光淬灭基团为DABCYL、BDH和TANRA中的一种。
[0010] 本实用新型提供了一种用于检测食品中细菌的的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0011] (1)上述所述的探针；
[0012] (2)重悬固定液；
[0013] (3)杂交液；
[0014] (4)洗涤液；
[0015] 所述重悬固定液包括：
[0016] Tris-HCl 50-150 mMpHB.O, DM SO 3%~10% (v/v), CaCl2 5~20mM, DEPC 0.1%~l%(v/v)， P-巯基乙醇 1%~5% (v/v)，
[0017] 曱醇 20%~45% ( v/v)。
[0018]优选地，所述杂交液包括 5% (w/v)PEG，50mMNaCl，40% (v/v)甲酰胺，0? 5% (w/ v)过硫酸按，1% (w/v)DEPC，l% (w/v)聚鹿糖，50mMEDTA，0.1% (v/v)TritonX-100,50mM pH8.0 的Tris-HCl;
[0019]所述洗涤液包括 50mMTris-HCl(pH10.0)，0.5MNaCl，0. 1% (v/v)NP-40,0.5% (v/v)TritonX-100〇
[0020] 本实用新型还提供了一种快速检测食品中细菌的方法，所述方法采用上述所述试 剂盒来检测，所述方法包括以下步骤：
[0021] (la)取待检食品样品，加入到重悬固定液中，震汤混勾；
[0022] (2a)取步骤（la)中混匀后的液体滴在载玻片上，然后烘干；
[0023] (3a)将步骤（2a)中获得的载玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；
[0024] (4a)在浸泡后的载玻片上的待检位置加入杂交液和探针，置于杂交炉中避光杂 交；
[0025] (5a)将步骤（4a)中获得的载玻片浸入预热的洗涤液中洗涤，然后烘干；
[0026] (6a)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用10X物镜扫视和计数，用40或100X 物镜观察细菌形态；
[0027] 或者所述方法包括以下步骤：
[0028](lb)取待检食品样品，加入到重悬固定液中，震汤混勾；
[0029] (2b)过滤得到滤液；
[0030] (3b)取步骤（2b)中得到的滤液滴在载玻片上，然后烘干；
[0031] (4b)将步骤（3b)中获得的载玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；
[0032] (5b)在浸泡后的载玻片上的待检位置加入杂交液和探针，置于杂交炉中避光杂 交；
[0033] (6b)将步骤（5b)中获得的载玻片浸入预热的洗涤液中洗绦，然后烘干；
[0034] (7b)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用10X物镜扫视和计数，用40或100X 物镜观察细菌形态。
[0035]上述所述步骤（la)、（lb)是通过重悬固定液使食品样品中的细菌与食品成分分 开，并且使分开的细菌悬浮于重悬固定液中，上述所述步骤（2a)、（3b)是为了使待检食品 样品中的细菌固定在载玻片上。
[0036]优选地，所述步骤（la)、（lb)中所述待检食品样品与所述重悬固定液的体积比 为1:1~1:5,所述步骤（2a)中所述液体滴加的体积为10yL，所述步骤（3b)中所述滤液 滴加的体积为10UL，所述步骤（2a)、（3a)、（5a)、（3b)、（4b)、（6b)中的烘干温度为52~ 58°C，所述步骤（3a)、（4b)中所述浸泡时间为5分钟，所述步骤（5a)、（6b)中洗涤液的预热 温度为52~58°C，所述步骤（5a)、（6b)中所述洗涤时间为5~20分钟。
[0037]优选地，所述步骤（3a)、（4b)中所述杂交液的加入体积为20yL，所述探针加入后 的浓度为20ng/L。
[0038]优选地，所述步骤（3a)、（4b)中杂交温度为52°C，杂交时间为30分钟。
[0039] 本实用新型所述试剂盒和检测方法的技术要点或原理：本实用新型所述重悬固定 液可以快速将食品中的细菌与食品成分分开，并使之易于结合到载玻片上。荧光原位杂交 (FlourescenceinsituHybridization，FISH)是一种应用标记有焚光物质的探针