荧光素标记的dna探针的基因检测系统的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种基因检测系统，特别涉及一种DNA电化学生物传感器。
【背景技术】
[0002]众所周知，DNA传感器是以DNA为敏感元件，通过换能器将DNA与DNA、DNA与RNA、DNA与其它有机无机离子之间的作用的生物学信号转变为可检测的光、电、声波等物理信号的电化学生物传感器。它们是基于探针DNA变化发展而来的一种新型的DNA传感器。其中，探针DNA是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可以是线状或者环状DNA，可用来快速检测病原体。探针DNA—般一端修饰巯基，一端修饰已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等指示剂。通过金-硫键的作用自组装到金电极表面。与固定的靶DNA互补杂交后，探针DNA的构型会改变，使得探针DNA指示剂与电极表面的电子传递效率改变，从而改变电信号，完成指示杂交，可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。探针DNA利用了 DNA分子杂交原理，可以用来诊断寄生虫病，现场调查及虫种鉴定，可用于病毒性肝炎的诊断，遗传性疾病的诊断，可用于检测饮用水病毒含量。
[0003]目前，这种简单的传感器被广泛地应用于DNA、酶、金属离子和有机小分子的研究。但是有些DNA的构象改变非常复杂，而对于简单的传感器，其灵敏度和选择性还需要进一步提尚O
[0004]如中国专利公开第102286371号提供的一种基于探针DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器，包括电极和捕获探针DNA，电极采用金电极，捕获探针DNA采用巯基修饰的DNA，其特征是巯基修饰的DNA在室温下与金电极通过Au-S键的化学键合作用以及探针碱基部分与金的吸附作用而修饰到金电极表面使捕获探针DNA平躺于金电极表面形成捕获探针DNA组装层;在捕获探针DNA组装层的表面有牛血清白蛋白作为封闭剂和保护剂。通过杂交前后阻抗值的变化作为指示信号，该方法利用表面组装化学技术构建“平躺”型DNA探针识别界面，同时使探针的形态不受空白杂交条件的影响而保持平躺于电极表面。然而，该发明提供的DNA电化学传感器的DNA探针是平躺在电极表面，并没有形成具有高灵敏性的DNA探针弓装结构，“平躺’型DNA探针遮盖电化学传感器面积较大，传感器所结合的DNA探针数量少。
[0005]又如中国专利公开第103048369号提供的一种基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的金黄色葡萄球菌无标记电化学适配体传感器，基于还原氧化石墨稀-纳米金复合材料结合适配体检测金黄色葡萄球菌的方法，其基本原理是利用还原氧化石墨烯-纳米金复合材料，用层层自组装的方法修饰巯基化的金黄色葡萄球菌全菌捕获探针。当探针在金黄色葡萄球菌菌液中孵育，它的有效结合位点会与金黄色葡萄球菌结合，将其包裹在三维空间结构中，实现对目标菌的全菌“捕获”。由于结合目标菌后会阻碍电极表面的电子传输，使电化学阻抗值增大，利用阻值的变化实现对金黄色葡萄球菌的定量检测。但该电化学适配体传感器中纳米金颗粒直接自组装在玻碳电极表面的石墨稀膜上，这使得玻碳电极包覆石墨烯膜的工艺复杂成本高;此外，所选用DNA探针为一端修饰有巯基的DNA探针，不能形成弓形构造，不利于提高检测灵敏度。
[0006]再如中国专利公开第102788824号提供的一种DNA生物传感器制备方法，DNA生物传感器中硅片基底和金膜基底由石墨烯自组装薄膜组成，其中硅片基底为通过十八烷基三甲氧基硅烷自组装上石墨烯薄膜，而金膜基底为通过1-十八硫醇自组装上石墨烯薄膜。通过各种电学测试表明，自组装前后及DNA固定杂交前后电性能、元素组成及结构有明显的变化，并能明显观察到目标DNA浓度的变化对其峰值的影响。然而，该DNA生物传感器制备方法提供的DNA生物传感器未采用三电极系统，其DNA探针也并没有形成具有高灵敏性的弓装结构。
[0007]还如中国专利第104569101号公开的一种DNA电化学生物传感器及其制备方法，其包括金电极、与目的DNA序列互补的互补DNA、导电纳米颗粒以及可溶性电化学活性试剂，其中一段互补的单链DNA作为捕获探针组装于金电极上，并利用该单链DNA与导电纳米颗粒的结合作为电化学信号的转换单元，对DNA杂交事件进行电化学响应。该方法将吸附了导电纳米颗粒的巯基化DNA修饰金电极作为信号转换电极，利用可溶性电化学活性试剂的电极反应，基于DNA序列之间的碱基互补配对作用，对目标物DNA进行电化学响应和检测。然而，该DNA电化学生物传感器提供的DNA电化学传感器并没有形成具有高灵敏性的DNA探针弓装结构，而且是用金电极电解的方式制得纳米金颗粒，造价高而灵敏度低。
[0008]综上所述，尽管对DNA电化学生物传感器已经进行了大量的研究，但是提高检测灵敏度和选择性、降低DNA电化学生物传感器的成本依然是目前研究的重要方向。
【发明内容】
[0009]本实用新型的目的是为了克服以上现有技术的不足，提供一种荧光素标记的DNA探针的基因检测系统，该系统能够提供更多DNA探针结合位点，灵敏测得系统电路电流变化，减少成本、节约材料。
[0010]根据本实用新型的一个方面，提供一种荧光素标记的DNA探针的基因检测系统，包括:电流检测装置、用于盛放电解液的电解池、置于电解液中的三电极组，三电极组包括工作电极、参比电极和对电极，工作电极、参比电极和对电极分别通过引线与电流检测装置的第一接线端、第二接线端和第三接线端电连接，工作电极为掺石墨烯玻碳电极，其中，掺石墨稀玻碳电极中的石墨稀质量百分含量为10%。?15%。，包覆金纳米颗粒的聚合物微球自组装在掺石墨烯玻碳电极表面形成包覆聚合物微球纳米金层，DNA探针结合于包覆聚合物微球纳米金层上。
[0011]优选地，聚合物微球为Poly(E⑶ΜΑ-co-VPy)微球。此外，聚合物微球也可以选择Po Iy (EGDMA-co-HEMA)微球。
[0012]优选地，电流检测装置控制电极电势在一定范围内以恒定的变化速率扫描，使得电极电势从第一电势变化至第二电势，再按相同速率从第二电势变化至第一电势，同时记录相应的响应电流，得到伏安特性曲线。
[0013]可选择地，使用的电流检测装置可为电化学工作站，型号为CHI600E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，或者选用型号为RST5200电化学工作站(郑州世瑞思仪器科技有限公司)。
[0014]可选择地，电流检测装置的第一接线端、第二接线端和第三接线端分别对应于电化学工作站的工作电极接入端、参比电极接入端和对电极接入端。
[0015]可选择地，DNA探针的两端分别修饰有荧光素和巯基，巯基与纳米金层通过金-硫键结合，通过纳米金层对DNA探针上修饰的荧光素的表面吸附力使DNA探针弯曲形成弓型结构，形成DNA探针层。
[0016]可选择地，包覆Poly (EGDMA-co-VPy)微球纳米金层表面组装一层牛血清蛋白分子层以覆盖包覆Poly(EGDMA-C0-VPy)微球纳米金层上未与DNA探针结合的区域。
[0017]根据本实用新型的另一方面，提供一种荧光素标记的DNA探针的基因检测系统的制备方法，包括:(1)、按质量比20?30:1准备聚丙烯腈树脂和石墨烯，将准备好的聚丙烯腈树脂在氩气气氛中缓慢加热至1200摄氏度?1800摄氏度得到玻碳，将玻碳降温至800摄氏度?1000摄氏度加入准备好的石墨烯搅拌混合后冷却得到掺石墨烯玻碳；(2)、根据所需尺寸切割掺石墨烯玻碳获得掺石墨烯玻碳电极；(3)、将得到的掺石墨烯玻碳电极依次在硝酸溶液、二次蒸馏水、丙酮中超声洗涤5?10分钟；(4)、准备粒径350?550纳米的Poly(EGDMA-co-VPy)微球；(5)、按体积比I?3:1准备柠檬酸钠溶液和氯金酸溶液，将准备好的氯金酸溶液按体积比为0.001?0.01:1加入到超纯水中加热，沸腾后加入准备好的柠檬酸钠溶液，充分搅拌反应液并保持沸腾态30?50分钟，当溶液颜色变成酒红色时停止加热，反应液自然冷却至室温后冷冻分离提纯，得到纳米金颗粒溶液；(6)、将步骤(4)准备的P0ly(EGDMA-C0-VPy)微球加入到步骤(5)制得的纳米金颗粒溶液中震荡30?50分钟，得到纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-Co-VPy)微球的自组装溶液；(7)、将掺石墨烯玻碳电极放入到纳米金颗粒包覆Po I y (E⑶MA-co-VPy)微球的自组装溶液中，密封浸泡2?5小时，取出掺石墨烯玻碳电极后用去离子水冲洗，氮气吹干，完成纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-C0-VPy)微球与掺石墨烯玻碳电极的自组装，在掺石墨稀玻碳电极上形成包覆Poly (EGDMA-co-VPy)微球的纳米金层；
(8)、将装配有巯基和荧光素的DNA探针溶液滴涂在掺石墨烯玻碳电极的纳米金层上，晾干后用二次水(二次蒸馏水)清洗，氮气吹干，得到DNA探针修饰的掺石墨烯玻碳电极。
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