本发明属于荧光探针
技术领域：
，更加具体的说，涉及一种铝离子荧光探针。
背景技术：
：铝是人体非必需元素，也是地壳中含量最丰富的金属元素，在大多数生物组织中以离子形式存在，并且广泛应用于现代生活中的各个方面。然而，对于一些人体至关重要的必需元素，如mg2+(0.066nm)、ca2+(0.099nm)和fe3+(0.064nm)等，由于铝元素具有跟它们相似的原子半径(0.051nm)和相似的价态(3+)，在不同的生物过程中铝离子能够作为一种竞争性抑制剂。近些年来，随着酸雨量的增加，使土壤中的铝含量不断增加，铝元素以离子形式存在时(al3+)，对植物的生长有很强的抑制毒性；而水体中存在高浓度的al3+会导致大量有机物凝聚，致使水中的鱼类和其他水生物种营养匮乏而死。另外，相关研究表明，人体内al3+过量时，可导致低色小红细胞性贫血、铝相关性骨骼疾病(arbd)、脑病，铝中毒引起的神经系统紊乱可导致痴呆、肌肉病变、阿尔兹海默症等。根据世界卫生组织(who)的规定，人体每天摄入铝离子含量在3—10mg左右，且每周摄入量应按个人体重不超过2mg/kg。因此，能够实时追踪和检测人体内铝离子的含量显得尤为重要，同时，控制生物体摄入铝离子的浓度对人体健康也很有必要。在现有的检测铝离子含量的方法中，荧光探针法因为其具有操作简便、高灵敏度、高选择性、实时性、肉眼可观测，且成本较低等特点，在食品药品、生命科学和环境监测方面有较为广泛的应用。近年来，设计、合成具有铝离子选择性的荧光探针，研究开发出能够实时、便捷地监测al3+的探针受到了科学家们极大的关注。然而目前，铝离子荧光探针的开发面临着一定的困难和挑战。由于铝离子的配位能力较弱，且其在水溶液中水合能力较强，铝离子的检测经常被干扰离子的存在所影响。迄今为止，已报道的铝离子荧光探针与其他过渡金属离子探针相比，所取得的成果并不是那么的令人满意。同时，文献报道的主要的铝离子探针，其所具有的局限性在于合成过程复杂、在水溶液中的应用性较差等，几乎目前所有文献中报道的铝离子探针都是在有机溶剂或者混合溶剂中进行测定的。因此，能够研究和开发出新型的，不仅对铝离子有特异性响应，而且能有效地竞争水溶液中的水合铝离子使其能在水溶液环境下检测al3+的探针，以便今后应用于生命体内，是非常迫切而有必要的。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供可作为高灵敏度的铝荧光探针而加以利用的化合物。和文献现有铝离子探针相比较，本发明探针具有灵敏度高，检测下限低(纳摩尔浓度nmol/l量级)，选择性高，稳定性强，制备简单、合成成本低等优势。本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：铝离子荧光探针，具有如下分子式所示的结构：其中r选自h、cl、ch3或者no2。铝离子荧光探针的制备方法，进行如下反应进行制备：其中r选自h、cl、ch3或者no2，选择两种原料为等摩尔比例投料，选择有机溶剂溶解分散反应原料，在设定的反应温度进行充分回流反应，待反应结束后抽滤旋蒸和重结晶。在上述技术方案中，反应温度为60—80摄氏度，优选70—80摄氏度。在上述技术方案中，回流反应时间至少为2小时，优选4—6小时。在上述技术方案中，有机溶剂能够溶解并均匀分散两种原料，如无水乙醇、丙酮或者四氢呋喃。具有如下分子式所示的结构的化合物在铝离子检测中的应用，与铝离子形成的配合物在450nm激发波长下，在最大发射光波长λem＝518nm处具有很强的荧光峰，最大激发波长为450nm。在0.05-0.25μm铝离子浓度范围内，荧光强度呈现出良好的线性关系。其中r选自h、cl、ch3或者no2。在上述分子式所示的分子结构中，由于希夫碱氮原子的光诱导电子转移(pet)现象，该分子本身发射出的荧光强度较弱，但当加入铝离子以后，在酚羟基氧原子和希夫碱氮原子处配位，使希夫碱氮原子的pet效应得到有效抑制。同时，由于分子中的多点参与配位出现了螯合荧光增强(chef)效应，使配位后的分子刚性增强，平面性增加，所以荧光发生了很大程度的增强。在使用上述化合物进行铝离子检测中，化合物产生显著的荧光增强趋势，并随着铝离子的浓度增大而增强，在0.05-0.25μm的铝离子浓度范围内，荧光强度呈现线性变化，且针对三价铝离子的检测下限为6.8×10-10m，灵敏度高。在使用上述化合物进行铝离子检测中，ph为6―10，优选6—7.5。使用上述化合物用于检测细胞内al3+浓度和分布。本发明荧光探针分子基于esipt原理，探针分子在结合铝离子前后荧光量子产率有大幅度的增长。荧光探针分子对铝离子有很好的选择性，响应迅速，阴离子(硫酸根离子、硝酸根离子、氯离子)不干扰荧光的现象，不同阳离子表现出对荧光强度的不同影响，钙离子、锌离子和cd2+增强荧光强度，mg2+、k+、na+、fe3+、mn2+、co2+对荧光强度干扰小，cu2+、cr3+、ni2+有淬灭作用。附图说明图1是利用本发明探针代表性化合物l6对人宫颈癌细胞系hela细胞中的al3+进行检测的示意图片。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。使用的仪器和原料如下表所示。仪器列表名称型号厂家熔点仪x-4数显显微熔点测定0010-548北京泰克红外光谱nicolet380thermoelectron核磁共振测定仪unity-plus400美国varian荧光光谱仪rf-5301日本岛津单晶x-射线衍射仪rigakusaturn724型日本理学激光共聚焦显微镜fv-1000日本奥林巴斯原料试剂列表实施例1探针代表性化合物l6(r＝h)的合成及表征称取2-羟基-1-萘甲醛1.72g(10mmol)和2-氨基苯酚1.43g(10mmol)溶于35ml无水乙醇溶液中,除水加热到70℃回流4小时，反应过程中随时用tlc检测，反应结束后，趁热抽滤，滤液用旋蒸法除去部分溶剂，析出棕色固体，抽滤，将滤饼用无水甲醇重结晶(byholzbecher,zavis.chemickelistyproveduaprumysl.1953,47,680-688)。最终得棕色晶状固体2.32g，产率80.55％。熔点：235.5-235.9℃。1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm)15.71(d,1h,oh-ar),10.29(s,1h,hc＝n),9.51(d,1h,oh-ar),6.78-8.39(m,10h,h-ar).ir(kbr,cm-1):3119.0w,3028.1w,2555.8br,1624.1s,1585.7w,1546.6s,1513.0w,1489.0w,1461.0s,1408.2m,1356.0s,1316.6s,1272.0s,1240.1s,1209.8m,1141.7s,1114.4s,1038.7w,992.8m,920.2w,862.0m,826.4m,743.2s，即可得知制备出本发明的代表性化合物l6(r＝h)。实施例2探针代表性化合物l6对铝的灵敏性使用合成的探针化合物l6评价其对铝离子的灵敏性。将探针代表性化合物l6加入到含2ml甲醇的样品池中，最终形成浓度为4μm的探针代表性化合物l6的甲醇溶液，然后向该甲醇溶液中依次分别加入氯化铝的水溶液，以使由甲醇和水组成的溶液体系中，氯化铝(即三价氯离子)的浓度为0-100μm，激发波长为450nm，最大发射波长在528nm，测试结果显示于下表中，以不添加氯化铝时探针代表性化合物l6的强度7.95为基准imin，每次添加氯化铝后时时检测的强度为i，以i/imin来表示强度的变化和对比。从表中可以看出配体l6在甲醇-水溶液中和铝离子络合时的荧光强度变化。l6对不同浓度al3+的荧光响应在该体系中，由于希夫碱氮原子的光诱导电子转移(pet)现象，配体l6本身发射出的荧光强度较弱，但当加入铝离子以后，在酚羟基氧原子和希夫碱氮原子处配位，使希夫碱氮原子的pet效应得到有效抑制。同时，由于配体中的多点参与配位出现了螯合荧光增强(chef)效应，使配位后的分子刚性增强，平面性增加，所以荧光发生了很大程度的增强。因此，随着al3+的加入，l6产生显著的荧光增强趋势，并随着铝离子的浓度增大而增强，且针对三价铝离子的检测下限为6.8×10-10m。实施例3探针代表性化合物l6的对铝的选择性使用合成的探针代表性化合物l6评价其对铝离子的选择性。首先制备浓度为4μm的l6储备液(即l6的甲醇溶液)以及各种常见钠盐、钾盐、钙盐、镁盐以及其他过渡金属盐(金属的盐酸盐)的水溶液，将金属盐的水溶液和配体l6充分混合稳定40min后，依次对其混合溶液进行荧光强度检测(激发波长为450nm，最大发射波长在528nm)，以纯l6的甲醇溶液进行荧光相应的强度i0为基准，以其他各个离子与l6的混合溶液的强度为i。实验结果如下表所示：l6对al3+的响应非常明显，而当与其它金属离子如k+,na+,ca2+,mg2+,fe3+,cr3+,cu2+,co2+,ni2+,zn2+,cd2+,fe2+混合时荧光强度没有发生明显的变化。根据本实验现象可以判断，荧光探针l6对三价铝离子具有较好的选择性，分别选用硫酸盐和硝酸盐，基本表现出与盐酸盐一致的选择性。l6对常见金属离子的荧光响应强度intensity(a.u./at528nm)i/i0l619.581.00l6+k+18.590.95l6+na+17.760.91l6+ca2+19.040.97l6+mg2+17.700.90l6+fe3+13.110.67l6+cr3+21.481.10l6+cu2+10.970.56l6+co2+12.120.62l6+ni2+5.720.29l6+zn2+10.500.54l6+cd2+15.360.78l6+fe2+9.000.46l6+mn2+11.540.59l6+al3+543.6927.77实施例4探针代表性化合物l6与铝离子结合产生荧光的抗干扰性由于生物体内是一个存在着各种金属离子的复杂缓冲盐体系，能够应用于生物体内的荧光探针必须对其他干扰离子具有较强的竞争能力和强大的抗干扰能力。为此，检测l6化合物在其他金属离子存在时，能否达到作为检测al3+探针的要求。选择甲醇和水的混合溶液(甲醇和水的体积比为9:1)作为体系，加入化合物l6，以使化合物l6的浓度为2μm，再加入氯化铝的水溶液(al3+)，以使三价铝的浓度为2μm，稳定30min后测定其荧光强度(测试条件同上，强度为i0)在上述混合溶液中分别加入其他金属离子的水溶液(即金属盐的水溶液，金属盐选择为盐酸盐)，以使金属离子浓度在最终体系中为2μm，稳定相同的时间后(30min)检测其荧光强度的变化，记录如下表所示。从中可以看出，体内常见其他金属离子对l6-al3+的荧光强度均有影响，有增强荧光强度的，如钙离子、锌离子和cd2+；有淬灭作用的，如cu2+、cr3+、ni2+；对荧光强度干扰较小的，如mg2+、k+、na+、fe3+、mn2+、co2+。将金属盐选用硫酸盐和硝酸盐，基本表现出与盐酸盐一致的性能。l6检测铝离子的抗干扰性能intensity(a.u./at528nm)i/i0×100％l6+al3+721.58100.00l6+al3++mg2+725.54100.55l6+al3++k+796.52110.39l6+al3++na+744.09103.12l6+al3++ca2+865.55119.95l6+al3++fe3+664.7792.13l6+al3++cr3+130.4418.08l6+al3++mn2+711.3398.58l6+al3++co2+777.01107.68l6+al3++ni2+550.2976.26l6+al3++cd2+802.91111.27l6+al3++zn2+925.78128.30l6+al3++cu2+117.2916.25实施例5探针代表性化合物l6在不同ph条件下对al3+荧光响应强度甲醇和水的混合溶液(甲醇和水的体积比为9:1)作为体系配置不同ph值的缓冲溶液(ph为2～11)，向不同ph值体系中添加化合物l6和a13+(氯化盐)，化合物l6的浓度为4μm，三价铝离子的浓度为3μm。如下表所示，在ph值极低或极高的情况下，其荧光强度很弱，在ph为6—10的范围内，l6产生3-30倍的荧光响应强度，其中，当ph为7时，荧光强度增加约30倍，而生物体内的ph范围是6.0-7.6，由此可以看出，l6在生理环境下对铝离子的荧光响应是非常有意义的，有望应用于生物体内检测a13+的含量。l6在不同ph条件下对al3+荧光响应强度phintensity(a.u./at528nm)28.6436.82422.68529.23693.987233.878106.2982.201087.131135.56实施例6探针代表性化合物l6检测hela细胞内al3+综合上述的光谱实验研究可以看出，l6能够特异、灵敏地识别al3+，因此，为了进一步拓展探针分子l6的应用范围，借助激光共聚焦显微镜对人宫颈癌细胞系hela细胞中的al3+进行检测。首先将hela细胞在100μm铝离子(氯化铝的水溶液)暴露的条件下处理3h，经过充分的洗涤(冰冷的pbs洗涤3次)，以除去细胞表面多余的铝离子，随后加入含有l6的细胞培养液(l6的浓度为5μm)，在37℃、5％co2(体积百分数)的条件下继续培养0.5h后弃去含有探针分子的培养液，使用冰冷的pbs洗涤3次后，使用激光共聚焦显微镜进行检测(405nm激光器激发，发射波长范围为424-464nm)，结果见图1，图中绿色区域即为分散有三价铝离子的区域，并可根据显色区域的颜色的深浅，判断三价铝离子的多少和分布，为进一步的检测提供依据。根据
发明内容的记载，调整r为cl、ch3或者no2，针对三价铝离子进行检测，表现出与上述实施例(r为h)基本一致的性质。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。当前第1页12