本发明涉及光功能材料领域，具体涉及一种近红外光激发荧光染料及其制备方法与应用。
背景技术：
荧光检测技术在DNA杂交测试、免疫检测、基因重组检测等方面的广泛应用极大促进了近红外光激发荧光染料的发展，仅过去几年间就有大量文献和专利对这类功能性染料的研究及应用进行了报道。近红外光激发荧光染料的发射波长为700～1200nm，在该范围内生物分子自身荧光较弱，可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度，同时还能减少对生命体的损伤。近红外光激发荧光染料可以作为一种安全、非侵入性的成像探针广泛应用于医学和生物学领域，具有广泛的应用前景。目前常用的近红外光激发荧光染料有菁染料酞青类染料和氮杂BODIPY类染料等。菁染料的最大吸收和发射波长一般都超过了600nm共轭体系之间的N-N原子之间的脒离子插烯物是菁染料的发色团，然而这类菁染料的缺点是光稳定差，多甲川结构容易在光照下氧化断裂，导致染料分解，影响了染料在应用方面的推广；酞青类染料的中心可容纳Zn、Ni、Pt、Pd、Al、Ge等金属原子，有两个吸收带，且对光、氧、热有较好的稳定性，但是这类酞青染料的溶解性很差，况且分子体积较大，在生物应用时会对生物分子的生理活性有一定影响；氮杂BODIPY类荧光染料是近几十年才发展起来并受重视的一类新型荧光化合物，具有较高的摩尔消光系数、很高的荧光量子产率、较高的光稳定性、低毒性、基本不受溶剂极性和pH值的影响等优点广发应用于荧光探针、生物分子标识与检测等领域，然而这类染料母体的合成往往比较困难，步骤复杂，而且原料难得，限制了在生化分析上的应用。
技术实现要素：
因此，本发明的要解决的技术问题在于克服现有技术中的近红外光激发荧光染料光稳定性差、母体分子合成步骤复杂以及在生物识别领域存在的各种缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的一种近红外光激发荧光染料，具有如式(I)所示的结构：
其中，
可选的，R1、R2、R3选自氢、C1-C10烃基、芳香基或杂环中的一种。
可选的，R1、R2、R3选自氢、甲基、乙基、苯基、2-噻吩基、3-噻吩基中的一种。
可选的，其结构式如(II)(III)(IV)(V)所示：
可选的，包括如下步骤：
(1)中间体1-I制备
在茄型瓶中加入无水氯化铝，二氯甲烷，置于冰盐浴中，搅拌，降温至0℃～-3℃，加入4-溴-2，3-二(氯甲基)-1H-吡咯，继续降温至-7℃～-10℃，开始滴加氯乙酰氯，控制温度0℃～-4℃，反应10～12小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水，并采用碳酸钠调节pH值7.0～8.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体1-I。
(2)中间体2-I制备
将三氟化硼乙醚和三乙胺缓慢滴加到步骤(1)所得中间体1-I的二氯甲烷溶液中，不断搅拌，控制温度在35℃～40℃，反应5～7小时，直接蒸出溶剂，得到油状物，采用乙酸乙酯和石油醚(体积比为1∶8～1∶10)重结晶得到类白色固体，即中间体2-I。
(3)中间体3-I制备
在茄型瓶中加入无水氯化铝，二氯甲烷，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-2℃～-5℃，加入苯，继续降温至-7℃～-11℃，开始滴加中间体2-I的二氯甲烷溶液，控制温度-6℃～-9℃，反应16～20小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水，并采用碳酸钠调节pH值7.0～8.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体3-I。
(4)化合物I制备
在茄型瓶中加入无水氯化铝，二氯甲烷，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-4℃～-7℃，加入R1，R2，R3取代的1，2，4-苯三酚，继续降温至-10℃～-13℃，开始滴加中间体3-I的二氯甲烷溶液，控制温度-8℃～-12℃，反应7～9小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水，并采用碳酸钠调节pH值7.0～8.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得到黄色固体，即化合物I。
可选的，所述步骤(1)中，加入4-溴-2，3-二(氯甲基)-1H-吡咯、氯乙酰氯、无水氯化铝物质的量比为1∶(3.0～4.0)∶(6～8)。
可选的，所述步骤(2)中，加入三氟化硼乙醚、三乙胺体积比为(1.5～2.0)∶1。
可选的，所述步骤(3)中，加入苯、中间体2-I、无水氯化铝物质的量比为1∶(2.5～3.0)∶(6～8)。
可选的，所述步骤(4)中，加入R1，R2，R3取代的1，2，4-苯三酚、中间体3-I、无水氯化铝物质的量比为1∶(3.0～3.5)∶(6～8)。
本发明还提供近红外光激发荧光染料的方法在细胞成像、荧光探针、激光染料、有机非线性光学材料、光电功能器件中的应用。
本发明的上述技术方案具有以下优点：
1.本发明实施例提供的一种近红外光激发荧光染料，由于含有苯环或杂环并带有共轭双键，由于O或N原子的非成键电子在激发态时，会被激发到π*键，表现为扩大了有机荧光分子的大π键，使整个有机荧光分子的共轭体系扩大，起到增强有机分子荧光作用。
2.本发明实施例提供的一种近红外光激发荧光染料，该荧光染料合成工艺简单，具有良好的生物相容性、低毒性、较长的荧光发射和较高的量子产率，可以避免背景荧光用于生物体系中生物大分子如核酸或蛋白质的共价荧光标记，对于研究疾病或者生物的发育、繁殖、遗传有很重要的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1-4近红外光激发荧光染料在乙醇中的激发和发射光谱；
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明实施例所用的试剂等基础化工原料，均可在国内化工产品市场买到，或在有关中间体制备厂定做。
实施例1
本实施例提供的近红外光激发荧光染料(II)的制备方法：
具有式(II)结构：
其制备方法如下：
(1)中间体1-II制备
在100ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.06mol，二氯甲烷20ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至0℃，加入4-溴-2，3-二(氯甲基)-1H-吡咯0.01mol，继续降温至-10℃，开始滴加氯乙酰氯0.03mol，控制温度-4℃，反应12小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水25ml，并采用碳酸钠调节pH值8.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体1-II。
(2)中间体2-II制备
将三氟化硼乙醚30ml和三乙胺20ml缓慢滴加到步骤(1)所得中间体1-II的二氯甲烷溶液20ml中，不断搅拌，控制温度在38℃～40℃，反应5小时，直接蒸出溶剂，得到油状物，采用乙酸乙酯和石油醚(体积比为1∶8)重结晶得到类白色固体，即中间体2-II。
(3)中间体3-II制备
在250ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.048mol，二氯甲烷15ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-2℃，加入苯0.008mol，继续降温至-11℃，开始滴加中间体2-II 0.02mol的二氯甲烷20ml溶液，控制温度-9℃，反应16小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水20ml，并采用碳酸钠调节pH值7.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体3-II。
(4)化合物II制备
在250ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.03mol，二氯甲烷10ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-4℃，加入1，2，4-苯三酚0.005mol，继续降温至-10℃，开始滴加中间体3-II0.015mol的二氯甲烷10ml溶液，控制温度-8℃，反应7小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水，并采用碳酸钠调节pH值7.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得到黄色固体，即化合物II。
本实施例中，对本发明近红外光光激发荧光染料(II)进行检测及表征数据如下：
元素分析计算值(CHBFNO)：C36H26BF2N3O6
质谱(MS+)：645.42(M+)
m/z：645.19(100.0％)，646.19(40.6％)，644.19(24.8％)，645.20(9.8％)，647.19(9.0％)，646.20(2.2％)，648.20(1.5％)
元素分析：C，66.99；H，4.06；B，1.68；F，5.89；N，6.51；O，14.87。
实施例2
本实施例提供的近红外光激发荧光染料(III)的制备方法：
具有式(III)结构：
其制备方法如下：
(1)中间体1-III制备
在500ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.4mol，二氯甲烷150ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-3℃，加入4-溴-2，3-二(氯甲基)-1H-吡咯0.05mol，继续降温至-8℃，开始滴加氯乙酰氯0.2mol，控制温度-3℃，反应11小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水100ml，并采用碳酸钠调节pH值8.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体1-III。
(2)中间体2-III制备
将三氟化硼乙醚120ml和三乙胺60ml缓慢滴加到步骤(1)所得中间体1-III的二氯甲烷溶液80ml中，不断搅拌，控制温度在37℃～38℃，反应7小时，直接蒸出溶剂，得到油状物，采用乙酸乙酯和石油醚(体积比为1∶9)重结晶得到类白色固体，即中间体2-III。
(3)中间体3-III制备
在1000ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.32mol，二氯甲烷150ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-4℃，加入苯0.04mol，继续降温至-9℃，开始滴加中间体2-III0.04mol的二氯甲烷50ml溶液，控制温度-8℃，反应20小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水100ml，并采用碳酸钠调节pH值7.5，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体3-III。
(4)化合物III制备
在1000ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.24mol，二氯甲烷100ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-6℃，加入3-甲氧基-2-苯氧基苯酚0.03mol，继续降温至-11℃，开始滴加中间体3-III0.105mol的二氯甲烷80ml溶液，控制温度-10℃，反应8小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水，并采用碳酸钠调节pH值7.5，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得到黄色固体，即化合物III。
本实施例中，对本发明近红外光光激发荧光染料(III)进行检测及表征数据如下：
元素分析计算值(CHBFNO)：C50H38BF2N3O6
质谱(MS+)：825.28(M+)
m/z：825.28(100.0％)，826.29(58.6％)，824.29(24.8％)，827.29(16.1％)，825.29(13.6％)，828.29(3.4％)，826.28(1.1％)
元素分析：C，72.73；H，4.64；B，1.31；F，4.60；N，5.09；O，11.63。
实施例3
本实施例提供的近红外光激发荧光染料(IV)的制备方法：
具有式(IV)结构：
其制备方法如下：
(1)中间体1-IV制备
在500ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.28mol，二氯甲烷100ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-2℃，加入4-溴-2，3-二(氯甲基)-1H-吡咯0.04mol，继续降温至-7℃，开始滴加氯乙酰氯0.14mol，控制温度0℃，反应10小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水100ml，并采用碳酸钠调节pH值7.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体1-IV。
(2)中间体2-IV制备
将三氟化硼乙醚130ml和三乙胺80ml缓慢滴加到步骤(1)所得中间体1-IV的二氯甲烷溶液100ml中，不断搅拌，控制温度在35℃～37℃，反应7小时，直接蒸出溶剂，得到油状物，采用乙酸乙酯和石油醚(体积比为1∶10)重结晶得到类白色固体，即中间体2-IV。
(3)中间体3-IV制备
在500ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.21mol，二氯甲烷70ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-5℃，加入苯0.03mol，继续降温至-7℃，开始滴加中间体2-IV0.03mol的二氯甲烷30ml溶液，控制温度-6℃，反应18小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水100ml，并采用碳酸钠调节pH值7.5，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体3-IV。
(4)化合物IV制备
在250ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.14mol，二氯甲烷50ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-7℃，加入3-乙氧基-2-(噻吩-2-基氧基)苯酚0.02mol，继续降温至-10℃，开始滴加中间体3-IV0.065mol的二氯甲烷50ml溶液，控制温度-13℃，反应9小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水，并采用碳酸钠调节pH值8.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得到黄色固体，即化合物IV。
本实施例中，对本发明近红外光光激发荧光染料(IV)进行检测及表征数据如下：
元素分析计算值(CHBFNOS)：C48H38BF2N3O6S2
质谱(MS+)：865.77(M+)
m/z：865.23(100.0％)，866.23(50.2％)，864.23(21.9％)，867.23(15.2％)，867.22(8.0％)，868.23(5.4％)，866.24(3.0％)，868.24(2.1％)，869.23(1.2％)
元素分析：C，66.59；H，4.42；B，1.25；F，4.39；N，4.85；O，11.09；S，7.41。
实施例4
本实施例提供的近红外光激发荧光染料(V)的制备方法：
具有式(V)结构：
其制备方法如下：
(1)中间体1-V制备
在1000ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.7mol，二氯甲烷200ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-2℃，加入4-溴-2，3-二(氯甲基)-1H-吡咯0.1mol，继续降温至-7℃，开始滴加氯乙酰氯0.3mol，控制温度-3℃，反应10小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水250ml，并采用碳酸钠调节pH值7.5，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体1-V。
(2)中间体2-V制备
将三氟化硼乙醚300ml和三乙胺200ml缓慢滴加到步骤(1)所得中间体1-V的二氯甲烷溶液200ml中，不断搅拌，控制温度在37℃～39℃，反应6小时，直接蒸出溶剂，得到油状物，采乙酸乙酯和石油醚(体积比为1∶9)重结晶得到类白色固体，即中间体2-V。
(3)中间体3-V制备
在1000ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.48mol，二氯甲烷150ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-3℃，加入苯0.08mol，继续降温至-7℃，开始滴加中间体2-V 0.24mol的二氯甲烷200ml溶液，控制温度-6℃，反应18小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水200ml，并采用碳酸钠调节pH值8.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得中间体3-V。
(4)化合物V制备
在250ml茄型瓶中加入无水氯化铝0.18mol，二氯甲烷100ml，置于冰盐浴中，搅拌，降温至-7℃，加入(3-乙氧基-2-(噻吩-3-基氧基)苯氧基)噻吩0.03mol，继续降温至-13℃，开始滴加中间体3-V 0.09mol的二氯甲烷70ml溶液，控制温度-12℃，反应9小时；将反应液缓慢倒入饱和碳素氢钠溶液中，加入去离子水，并采用碳酸钠调节pH值8.0，三氯甲烷萃取三次，收集有机相，采用无水硫酸镁干燥3小时，抽滤，蒸出有机溶剂，得到黄色固体，即化合物V。
本实施例中，对本发明近红外光光激发荧光染料(V)进行检测及表征数据如下：
元素分析计算值(CHBFNOS)：C56H42BF2N3O6S4
质谱(MS+)：1029.20(M+)
m/z：1029.20(100.0％)，1030.21(66.0％)，1028.21(24.6％)，1031.20(23.4％)，1031.21(19.9％)，1029.21(15.1％)，1032.20(11.9％)，1030.20(8.7％)，1032.21(6.1％)，1033.20(4.1％)，1033.19(1.2％)
元素分析：C，65.30；H，4.11；B，1.05；F，3.69；N，4.08；O，9.32；S，12.45。
实验例
为验证本发明所述的近红外光激发荧光染料的荧光性能，对其荧光光谱及摩尔消光系数、荧光量子产率进行测定，各参数的具体测定方法如下：
实验例1.近红外光激发荧光染料的吸收光谱测定
准确称取待测定化合物，配制成浓度为1.0×10-5mol/L的溶液，测定其吸收光谱，如图1所示。
实验例2.近红外光激发荧光染料的荧光光谱测定
利用测定的近红外光谱中的最大吸收波长，作为荧光光谱的激发波长，测定荧光光谱。称量待测化合物，配制浓度为1.0×10-6mol/L的乙醇∶水(50∶50，v/v)溶液，测定其发射光谱，如图1所示。
实验例3.近红外光激发荧光染料的摩尔消光系数测定
利用紫外可见吸收光谱测定化合物的摩尔消光系数。计算式如式(1)所示：
A＝εcl 式(1)
其中，A代表吸收强度，ε为摩尔吸光系数，c是化合物的浓度，l为检测用的石英池的厚度。
实验例4.近红外光激发荧光染料的荧光量子产率测定
在20℃下测定近红外光激发荧光染料的荧光量子产率，以硫酸奎宁(溶剂为0.1M的H2SO4，量子产率为0.56)作为参比物，通过测量近红外光激发荧光染料和参比物质的稀溶液在相同激发条件下得到的荧光积分强度和该激发波长下的紫外吸收值，来计算荧光量子产率。产物溶解于无水乙醇中。
计算公式如式(2)所示：
其中，其中Φ为待测物的量子产率，下标R代表参比物。I为荧光积分强度，A为紫外吸收值。η为溶剂折射率。一般要求吸光度A、AR均小于0.1。
表1实施例1-6所述近红外光激发荧光染料的光谱学性质
如表1所示，实施例4所述的近红外光激发荧光染料(VII)具有最大的吸收波长，同时对应着最大的发射波长829nm、最大的摩尔吸光系数9.0和最大的荧光量子产率89.86％，进而表明该类化合物具有用于生物大分子如核酸或蛋白质的共价荧光标记的优势。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。