本发明涉及纳米医学诊断技术领域,具体涉及一种近红外纳米荧光探针及其制备方法。
背景技术:
量子点作为一种新型的纳米荧光探针,以其不同于宏观材料的独特物理化学性能,引起了国内外研究者广泛的兴趣。相比于可见光量子点,新型纳米荧光探针在近红外区发光,因其在组织中存在“生物近红外透明窗口”,近红外量子点更适用于生物成像、对活体细胞或组织内的成分进行实时检测、疾病诊断等医学领域的应用。
目前,近红外硫族荧光纳米粒子的研究处于飞速发展阶段,Ⅱ~Ⅵ族元素(CdSe、CdTe、HgS QDs等)、Ⅳ~Ⅵ族元素(如PbS QDs)等组成的半导体纳米晶体由于富含Hg2+、Cd2+、Pd2+,在如何通过包裹或其它方法来降低或消除其毒性上还需要进一步探索。而Ⅰ~Ⅵ族量子点(即Ag系硫族量子点)富含的Ag+、Cu2+所含的毒性很少或几乎没有,有利于Ⅰ~Ⅵ族近红外量子点用于化学分析及生物医学应用;Ⅰ~Ⅵ族量子点是一类窄带宽的半导体材料,在近红外区发光,这使其在生物分析检测和荧光成像探针的有着优越的条件;Ⅰ~Ⅵ族近红外发光量子点由于自身具有的独特光学性质,且制备方法简单,易于进行表面功能化,因而在生物分析检测、细胞成像、肿瘤诊断等领域得到了广泛的研究和应用。
因此,利用量子点设计简单方便、便于对待检测物进行快速分析且成本低廉、操作简单的光学探针具有十分显著的实际意义和应用前景。相较于传统荧光染料,如异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)、罗丹明(Rhodamine)等,近红外量子点具有激发光谱宽且连续,光化学稳定性高,不易光解,荧光强度高而稳定,生物相容性好,毒性低等优点,广泛应用于细胞成像、肿瘤诊断等方面。
技术实现要素:
本发明的目的是提供一种近红外纳米荧光探针,该荧光探针具有长波长(近红外区)、光化学稳定高、绿色无毒,并能够应用于细胞成像和肿瘤诊断。
近红外量子点为Ag系硫族量子点,包括Ag2S、Ag2Se、Ag2Te。
近红外纳米荧光探针中近红外量子点与特异性分子氨基结合的制备方法:
(1)含羧基的近红外量子点的活化
取2 mM Ag系硫族量子点,用合适缓冲液(其中缓冲液可以是PBS7.4、MES缓冲溶液)稀释后,按照一定比例依次加入0.2 M的EDAC和0.2M的NHS或sulfo-NHS(QDs: EDC的摩尔比为1:50~1:200;EDC: sulfo-NHS的摩尔比为1:2.5~5:1),涡旋振荡器震荡均匀后常温旋转反应15~60 min;
(2)特异性分子标记
将步骤(1)活化的近红外量子点用30 KD超滤管在4℃条件下以8000 r/min速度离心10 min,超滤纯化后,加入PBS稀释,加入相对应单克隆抗体溶液(如Anti-alpha-SMA、Anti-CEA等,QDs和抗体的摩尔比为1:4~1:10),4℃反应过夜。溶液体系pH值优选为7~9;
(3)标记复合物纯化
将反应液离心后,近红外量子点标记的复合物用葡聚糖凝胶柱层析分离,收集有荧光的部分,即为近红外纳米荧光探针纯品。
本发明的系列近红外荧光探针都具有极好的生物相容性,体内毒性低,荧光信号强且稳定,与特异性受体的亲和性高,是细胞成像和肿瘤早期诊断的优选试剂。
下面是部分本发明系列近红外荧光探针的实验结果,其中NIR-Ag2S-alpha-SMA表示Ag2S量子点与alpha-SMA抗体偶联的近红外纳米荧光探针,其他表示方法类似。
一、近红外纳米荧光探针对细胞成像
近红外纳米荧光探针对细胞标记成像,操作步骤如下:
1)在培养板中将已爬好细胞,如成纤维细胞(FB)、人卵巢癌细胞(A2780)、人肺癌细胞(A549)的玻片用PBS(0.01M)浸洗3次,每次3 min;
2)用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,PBS浸洗玻片3次,每次3 min;
3)将细胞爬片用PBS7.4洗3×5 min后,用0.5%~1%的Trition-100在37℃条件下淹没20 min;
4)用PBS7.4洗3×5 min,加入山羊血清,37℃封闭1 h后;
5)加入对应的近红外纳米荧光探针(如NIR-Ag2S-alpha-SMA用于成纤维细胞(FB)成像、NIR-Ag2S--Ki67对人卵巢癌细胞(A2780)标记成像、NIR-Ag2Se-GAPDH用于人肺癌细胞(A549)成像),室温孵育2~3 h;
6)PBST洗3×5 min后,室温下DAPI染核,20 min;
7)PBST洗3×10 min,用含抗荧光淬灭剂的封片液,封片;
8)在激光扫描共聚焦显微镜下观察采集图像。
其中PBST:PBS7.4磷酸缓冲溶液中加入0.02%-0.05%Tween-20。
二、肿瘤标记物蛋白芯片
蛋白质芯片制备方法:
1)用不锈无菌裁纸刀裁取所需大小及所需孔径的多孔纤维素膜,如2平方厘米的0.45 μm孔径的硝酸纤维素膜(NC膜);
2)用微量喷印设备将捕获抗体(如Anti-CEA、Anti-AFP、Anti-CA199)以微阵列形式喷印到NC膜上,每孔0.5 μL;
3)用含有1%的牛血清白蛋白的0.01M PBS缓冲液,封闭40~60 min;
4)37℃干燥2 h后即得蛋白质芯片。
肿瘤标记物检测:
取样本孵育,PBS洗涤后,加对应近红外纳米荧光探针(CEA对应NIR-Ag2S-CEA荧光探针、AFP对应NIR-Ag2Se-AFP荧光探针、CA199对应NIR-Ag2S-CA199荧光探针等),检测出现红色或橙红色荧光斑点为含有相应的抗原。
本发明制备的近红外纳米荧光探针直接标记一抗,相对于一般免疫荧光实验来说,实验过程中无需避光、操作简单,替代了一抗与二抗的繁琐操作,近红外纳米荧光探针具有激发光谱宽且连续,光化学稳定性高,不易光解,荧光强度高而稳定,生物相容性好,毒性低,且其荧光在近红外区,荧光背景更少等优点。本发明制备的近红外纳米荧光探针在细胞成像、肿瘤诊断上有着广泛的应用。
附图说明
图1成纤维细胞(FB)成像:DAPI(左)、NIR-Ag2S-alpha-SMA探针标记(中)、影像重叠(右);
图2 人卵巢癌细胞(A2780)成像:DAPI(左)、NIR-Ag2S--Ki67探针标记(中)、影像重叠(右);
图3 人肺癌细胞(A549)成像:DAPI(左)、NIR-Ag2Se-GAPDH探针标记(中)、影像重叠(右);
图4 癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)蛋白检测芯片。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述,但本发明不限于此。
本发明所述量子点可为Ag系硫族近红外量子点,如Ag2S、Ag2Se、Ag2Te。本发明所述的量子点可以采用任何方法制备,也可以采用如下方法制备:
本发明所述的Ag系硫族近红外量子点按照覃爱苗等提供的方法(申请(专利)号:201410237382.X)进行:
1)在合成过程保持搅拌状态的体系中,将0.1mol/L的AgNO3溶液2~8 mL注入到100 mL去离子水中,加入0.2~2.0 mmol白色固体的L-半胱氨酸作为修饰剂,待溶解后用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节体系pH值至11,溶液体系呈无色透明,随后加入0.5~4 mL浓度为0.1 mol/L的S源溶液、10~30 mL浓度为5.0×10-3 mol/L的Se源或10~30 mL浓度为5.0×10-3 mol/L的Te源溶液,即得到近红外发光的Ag2S、Ag2Se或Ag2Te量子点;
2)所述S源为Na2S·9H2O;所述Se源为Na2SeO3在NaBH4的还原下制备的NaHSe;所述Te源为Na2TeO3在NaBH4的还原下制备的NaHTe;
3)Se源制备过程为量取100 mL去离子水,加入0 .0866 g ( 0.5mmol ) Na2SeO3,待溶解后加入0.2598 g NaBH4,密封系统且温度为90℃下反应而得到的浓度为5.0×10-3mol/L的Se源;Te源制备过程为量取100 mL去离子水,加入0.1108 g ( 0.5 mmol ) Na2TeO3,待溶解后加入0.3324 g NaBH4,密封系统且温度为90℃下反应而得到的浓度为5 .0×10- 3mol/L的Te源。
实施例1 近红外纳米荧光探针NIR-Ag2S-alpha-SMA的制备
近红外纳米荧光探针中近红外量子点与特异性分子氨基结合的制备方法:
(1)含羧基的近红外Ag2S量子点的活化;
取2mM Ag2S量子点用合适缓冲液(其中缓冲液是0.05M的MES缓冲溶液)稀释后,按照一定比例依次加入0.2 M的EDAC和0.2 M的NHS(QDs: EDC的摩尔比为1:50;EDC: NHS的摩尔比为1:2.5),涡旋振荡器震荡均匀后常温旋转反应15~60 min;
(2)特异性分子标记
将步骤(1)活化的近红外量子点用30 KD超滤管在4℃条件下以8000 r/min的速度,离心10 min,超滤纯化后,加入PBS稀释,加入相对应单克隆alpha-SMA抗体溶液(QDs和抗体的摩尔比为1:4~1:10),4℃反应过夜。溶液体系pH值优选为7~9;
(3)标记复合物纯化
将反应液离心后,近红外量子点标记的复合物用葡聚糖凝胶柱层析分离,收集有荧光的部分,即得近红外纳米荧光探针NIR-Ag2S-alpha-SMA。
其他近红外纳米荧光探针制备方法类似。
实施例2 NIR-Ag2S-alpha-SMA对成纤维细胞(FB)成像标记成像
NIR-Ag2S-alpha-SMA用于成纤维细胞(FB)成像,操作步骤如下:
1)在培养板中将已爬好成纤维细胞(FB)的玻片用PBS(0.01M)浸洗3次,每次3 min;
2)用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,PBS浸洗玻片3次,每次3 min;
3)成纤维细胞(FB)爬片用PBS7.4洗3×5 min后,用0.5%~1%的Trition-100在37℃条件下淹没20 min;
4)用PBS7.4洗3×5 min,加入山羊血清,37℃封闭1 h后;
5)加入NIR-Ag2S-alpha-SMA近红外纳米荧光探针,室温孵育2~3 h;
6)PBST洗3×5 min后,室温下DAPI染核,20 min;
7)PBST洗3×10 min,用含抗荧光淬灭剂的封片液,封片;
8)在激光扫描共聚焦显微镜下观察采集图像(图1)。
其中PBST:PBS7.4磷酸缓冲溶液中加入0.02%~0.05% Tween-20。
实施例3 NIR-Ag2S--Ki67对人卵巢癌细胞(A2780)标记成像
NIR-Ag2S--Ki67用于人卵巢癌细胞(A2780)成像,操作步骤如下:
1)在培养板中将已爬好人卵巢癌细胞(A2780)的玻片用PBS(0.01M)浸洗3次,每次3 min;
2)用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,PBS浸洗玻片3次,每次3 min;
3)人卵巢癌细胞(A2780)爬片用PBS7.4洗3×5 min后,用0.5%~1%的Trition-100在37℃条件下淹没40 min;
4)用PBS7.4洗3×5min,加入山羊血清,37℃封闭1h;
5)加入NIR-Ag2S--Ki67近红外纳米荧光探针,室温孵育2~3 h;
6)PBST洗3×5 min后,DAPI染核,室温20 min;
7)PBST洗3×10 min,用含抗荧光淬灭剂的封片液,封片;
8)在激光扫描共聚焦显微镜下观察采集图像(图2)。
其中PBST:PBS7.4磷酸缓冲溶液中加入0.02%~0.05%Tween-20。
实施例4 NIR-Ag2Se-GAPDH对人肺癌细胞(A549)标记成像
NIR-Ag2Se-GAPDH用于人肺癌细胞(A549)成像,操作步骤如下:
1)在培养板中将已爬好人肺癌细胞(A549)的玻片用PBS(0.01M)浸洗3次,每次3 min;
2)用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,PBS浸洗玻片3次,每次3 min;
3)人肺癌细胞(A549)爬片用PBS7.4洗3×5 min后,用0.5%~1%的Trition-100在37℃条件下淹没20 min;
4)用PBS7.4洗3×5 min,加入山羊血清,37℃封闭1h后;
5)加入NIR-Ag2Se-GAPDH近红外纳米荧光探针,室温孵育2~3 h;
6)PBST洗3×5 min后,DAPI染核,室温20 min;
7)PBST洗3×10 min,用含抗荧光淬灭剂的封片液,封片;
8)在激光扫描共聚焦显微镜下观察采集图像(图3)。
其中PBST:PBS7.4磷酸缓冲溶液中加入0.02%~0.05%Tween-20。
实施例5 癌胚抗原(CEA)蛋白芯片
蛋白质芯片制备方法:
1)用不锈无菌裁纸刀裁取所需大小及所需孔径的多孔纤维素膜,如2平方厘米的0.45μm孔径的硝酸纤维素膜;
2)用微量喷印设备将捕获CEA抗体以微阵列形式喷印到NC膜上,每孔0.5 μL;
3)用含有1%的牛血清白蛋白的0.01M PBS缓冲液,封闭40~60 min;
4)37℃干燥2 h后即为制备好的蛋白质芯片。
肿瘤标记物检测:
取样本孵育,PBS洗涤后,加NIR-Ag2S-CEA近红外纳米荧光探针,检测出现橙红色荧光斑点为含有相应的CEA抗原(图4)。
实施例6 甲胎蛋白(AFP)蛋白芯片
蛋白质芯片制备方法:
1)用不锈无菌裁纸刀裁取所需大小及所需孔径的多孔纤维素膜,如2平方厘米的0.45 μm孔径的硝酸纤维素膜;
2)用微量喷印设备将捕获AFP抗体以微阵列形式喷印到NC膜上,每孔0.5 μL;
3)用含有1%的牛血清白蛋白的0.01M PBS缓冲液,封闭40~60 min;
4)37℃干燥2h后即为制备好的蛋白质芯片。
肿瘤标记物检测:
取样本孵育,PBS洗涤后,加NIR-Ag2Se-AFP近红外纳米荧光探针,检测出现红色荧光斑点为含有相应的AFP抗原(图4)。