一种稀土染料及制备方法和应用与流程

本发明涉及一种新的活细胞标记染料，及其制备方法和应用。

背景技术：

光学成像在生物医学研究中起着重要的作用，尤其在生物学研究、临床前诊断与筛查以及图像引导治疗危及生命疾病方面具有重要的作用。光致发光光谱成像由于具有成像快速稳定、亚细胞结构分辨率高、灵敏度高以及生物毒性低的特点，使得其在生物成像的应用方面有巨大的优势。如今，光致发光材料已经被广泛报道，例如绿色荧光蛋白(gfp)、有机染料、量子点(qd)、稀土发光纳米粒子。

然而，绿色荧光蛋白(gfp)存在诸如易被蛋白水解酶水解以及与自发荧光光谱重叠等内在缺陷，使得它很难被用于体内细胞追踪实验。此外，绿色荧光蛋白(gfp)还有一个激发光光谱窄而发射光光谱宽的关键缺陷，这使得它不能通过单一的发射光来同时激发多种荧光蛋白。更糟糕的是，包括罗丹明、生物素以及4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)在内的这些商品化的有机染料同样也有严重的缺陷，这些染料在每平方1千瓦的共振照射下几秒就会发生快速且不可逆的淬灭或光漂白现象。而量子点在一定程度上可以克服光漂白的问题，它通常可以反应细胞的毒性同时显示单粒子能级的闪烁。因此，克服了目前光致发光材料中所存在的缺陷，可用于临床应用的理想化新型pl材料应具有以下特点：(1)连续且宽的发射光谱；(2)高耐光漂白性；(3)良好的生物相容性；(4)较高的亚细胞分变率。

幸运的是，能够发射更亮荧光和产生较少光漂白的稀土发光纳米粒子可以用来作为光致发光成像研究的潜在候选材料。具体地来讲，由于稀土纳米粒子中的每个单粒子中存在大量荧光发射器，使得其量子闪烁点会完全消失。并且稀土纳米粒子在光照下所发出的冷光是很稳定的，这使得稀土纳米粒子可以被持续观察任意长的时间。此外，具有不同形态、尺寸以及相位控制的发光稀土纳米粒子已经可以被合成制备，并且这些粒子的疏水表面通常会接受亲水性修饰，这一修饰过程对于粒子的生物相容性以及在生物医学中的应用非常重要。然而，目前大多数用于发光稀土纳米粒子表面修饰的方法都有两个重大的缺陷：纳米粒子的反应性和纳米粒子易团聚。更糟糕的是，虽然传统的稀土荧光材料具有较高的生物组织成像对比度，但是它们只有一个荧光发射峰，并且难以提供亚细胞级别的分辨率。通常，发光稀土纳米粒子具有两个优点：宽而连续的激发光谱，以及突出的耐光漂白性，而对一些地方进行改进之后又赋予其更好的生物相容性和亚细胞级别的分辨率。

因此，有必要设计一种新的稀土染料及制备方法和应用，以克服上述缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种稀土染料及制备方法和应用，具有同时标记出活细胞细胞质和细胞核的功能。

为达上述目的，本发明提供一种稀土染料，该稀土染料的化学组成为laof:cem,tbn，其中，1≤m≤5，0.5≤n≤1.5。

较佳的，该稀土染料的平均粒径小于等于10nm。

为达上述目的，本发明还提供上述稀土染料的制备方法，包括如下步骤：

a.将氟镧化合物，氟铈化合物和氟铽化合物按2：2:1加入到油氨溶液中，加热到230～300摄氏度，反应20分钟～1小时,反应产物用乙醚沉淀后，用丙酮溶液洗涤。

b.先将10～100mg的laof:ce,tb纳米晶体重新分散在甲苯中备用,然后在三角烧瓶中将0.1-1gpaa溶解在2～20ml丙三醇溶液中，加热至110摄氏度后，加入laof:ce,tb纳米晶体甲苯溶液，在持续通入氮气的条件下150～450转每分针磁力搅拌5-15分钟，加热至240摄氏度并保温1～3h，直至溶液变澄清，反应完成后，冷却至室温后，通过12000rpm离心30分钟，并用水-乙醇溶液(1:1)洗涤来获得laof:ce,tb@paa纳米晶体；

c.将所制备的laof:ce,tb@paa纳米晶体按0.5～5mg/ml浓度重新分散在2-吗啉代乙磺酸(mes)缓冲盐溶液中，ph6.0，加入2mm浓度的edc和5mm浓度nhs，使paa上的羧酸基团活化为琥珀酰亚胺酯，半小时后加入精氨酸，至终浓度为5～50mg/ml，调ph到7.0，反应12小时。在nhs/edc反应之后，通过12000rpm离心和磷酸盐缓冲液洗涤收集laof:ce,tb@paa@arg纳米晶体。

较佳的，在步骤a中，加热到270摄氏度。

较佳的，在步骤b中，先将30mg的laof:ce,tb纳米晶体重新分散在甲苯中备用,然后在三角烧瓶中将0.5gpaa溶解在10ml丙三醇溶液中。

较佳的，在步骤b中，在持续通入氮气的条件下300转每分针磁力搅拌10分钟。

较佳的，在步骤b中，加热至240摄氏度并保温1小时。

较佳的，在步骤c中，将所制备的laof:ce,tb@paa纳米晶体按1mg/ml浓度重新分散在2-吗啉代乙磺酸(mes)缓冲盐溶液中。

较佳的，在步骤c中，半小时后加入精氨酸，至终浓度为10mg/ml。

为达上述目的，本发明还提供上述稀土染料的用途，包括如下步骤：将制得的laof:ce,tb@paa@arg纳米晶体按照5μg/ml～25μg/ml的浓度混入细胞培养液，细胞培养12～48小时后，利用共聚焦显微镜或者荧光显微镜观察被荧光标记的活细胞的细胞质和细胞核。

与现有技术相比，本发明提供的laof:ce,tb@paa@arg纳米颗粒，由于具有很好的水溶性与生物相容性，又具有很好的双光荧光特性，因此，可以进行活细胞形态标记。更由于其独特的红绿双光荧光特性，可以同时标记出细胞的细胞质和细胞核。同时，相对的传统细胞标记染料，本发明具有光稳定性强，完全没有荧光漂白和荧光衰减的问题。

附图说明

图1.精氨酸功能化laof:ce,tb纳米晶体的合成及其生物成像的示意图；

图2.精氨酸功能化纳米晶体的形态和光谱表征图；

图中：(a)laof:ce,tb@paa@arg的hrtem图像中相应的tem图像和流体动力学尺寸(内部图)；(b)和(c)laof:ce,tb@paa@arg的hrtem图像；(d)laof:ce,tb@paa@arg的ft-ir光谱中相应的fft模型；(e)laof:ce,tb@paa@arg的ft-ir光谱；(f)laof:ce,tb@paa@arg和laof:ce,tb@paa的紫外吸收光谱；

图3.用于细胞成像的精氨酸功能化纳米晶体的荧光性能图；

图中：(a)laof:ce,tb@paa@arg和laof:ce,tb@paa的荧光光谱；(b)laof:ce,tb@paa@arg的白光图片和荧光图片；(c)所制备的laof:ce,tb@paa@arg在hepg2癌细胞成像中的应用；37℃下用laof:ce,tb@paa@arg(25mg/ml)孵育1小时后进行hepg2细胞的clsm成像；细胞核用hoechst染成蓝色；细胞质染为红色，整个细胞在激发光照射下染为绿色；细胞核和细胞质通过合并上述两个通道图像分别清晰地成像为绿色和黄色；

图4.laof:ce,tb@paa@arg和laof:ce,tb@paa对癌细胞和正常细胞的体外细胞毒性检测图；在用不同剂量的laof:ce,tb@paa@arg和laof:ce,tb@paa对hepg2(a)和l929(b)细胞孵育24小时后，使用标准阿尔玛蓝测定法(n＝5)来检测细胞活力；

图5.具有或不具有精氨酸修饰的合成纳米晶体在癌细胞成像图；

(a)在37℃下分别用laof:ce,tb@paa@arg和laof:ce,tb@pa(25mg/ml)温育hepg2细胞4小时，然后对hepg2进行clsm成像；通过合并绿色荧光和红色荧光，分别使细胞核呈绿色，而细胞质呈红色；并且将细胞核用hoechst染料染成蓝色来用于比较。(b)使用imagej软件来进行荧光定量分析；

图6.合成的光致发光纳米晶体在细胞成像应用中的光稳定性图；

在8小时白炽灯照射前后，用25mg/mllaof:ce,tb@paa@arg和钙黄绿素am孵育hepg2细胞，进行clsm成像；

图7.laof:ce,tb@paa@arg在纤维化细胞成像中的应用图。

具体实施方式

为使对本发明的目的、构造、特征、及其功能有进一步的了解，兹配合实施例详细说明如下。

在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定的元件。所属领域中具有通常知识者应可理解，制造商可能会用不同的名词来称呼同一个元件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分元件的方式，而是以元件在功能上的差异来作为区分的准则。在通篇说明书及权利要求当中所提及的「包括」为开放式的用语，故应解释成「包括但不限定于」。

本发明稀土染料的组成及制备方法

本发明提供一种稀土染料，该稀土染料的化学组成为laof:cem,tbn，其中，1≤m≤5，0.5≤n≤1.5。较佳的，m为3，n为1。

如图1所示，油胺包覆的45％铈和15％铽共掺杂氟氧化镧纳米晶体是由三氟乙酸酯前体通过高沸点溶剂法合成的。为了提升晶体疏水表面的亲水性，将油胺包覆的纳米晶体与聚丙烯酸(paa)反应，通过强配体交换反应形成paa包覆的laof：45％ce，15％tb纳米晶体(laof:ce,tb@paa)。为了增加渗透过膜能力和纳米晶体的生物相容性，通过edc/nhs化学反应将精氨酸缀合到纳米晶体(laof:ce,tb@paa@arg)的表面。同时为了共价修饰纳米晶体表面上的paa中的所有羧基，而向反应体系中加入过量的精氨酸。因此，纳米晶体上的精氨酸的数量可以被认为等于paa羧基的数目，其在30mg纳米晶体上大约有0.6mmol的量。

下面将结合具体的实施例，对本发明制备稀土染料的方法进行详细描述。

a.将三氟乙酸镧，三氟乙酸铈和三氟乙酸铽按2:2:1的比例加入到油氨溶液中，加热到230～300(例如230、270、300)摄氏度，反应20分钟～1小时，例如20分钟，半小时或者1h，反应产物用乙醚沉淀后，用丙酮溶液洗涤。

b.先将10～100mg(例如10mg、30mg、100mg)的laof:ce,tb纳米晶体重新分散在甲苯中备用,然后在三角烧瓶中将0.1～1g(例如，0.1g，0.5g，1g)paa溶解在2～20ml(例如2ml，10ml，20ml)丙三醇溶液中，加热至110摄氏度后，加入laof:ce,tb纳米晶体甲苯溶液，在持续通入氮气的条件下150～450(例如150、300、450)转每分针磁力搅拌5～15(例如5、10、15)分钟，再整个系统加热至240摄氏度并保温一定1～3h(例如0.5h、1h、1.5h)，直至溶液变澄清，反应完成后，冷却至室温后，通过12000rpm离心30分钟，并用水-乙醇溶液(1:1)洗涤来获得laof:ce,tb@paa纳米晶体；

c.将所制备的laof:ce,tb@paa纳米晶体按0.5～5mg/ml(例如，0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml)浓度重新分散在2-吗啉代乙磺酸(mes)缓冲盐溶液中，ph6.0，加入2mm浓度的edc和5mm浓度nhs，使paa上的羧酸基团活化为琥珀酰亚胺酯，半小时后加入精氨酸，至终浓度为5～50(例如5、10、20、30、40、50)mg/ml，调ph到7.0，反应12小时。在nhs/edc反应之后，通过12000rpm离心和磷酸盐缓冲液洗涤收集laof:ce,tb@paa@arg纳米晶体。

通过透射电子显微镜(tem)，动态光散射(dls)和高分辨率透射电子显微镜(hrtem)来进一步测定所制备的纳米晶体的形态，尺寸和物理结构。透射电子显微镜图像结果显示laof:ce,tb@paa@arg保持着单分散纳米结构，并且具有约小于10nm的均匀直径(图2a中所示为小于5nm)。由于官能化覆盖剂(paa和精氨酸)的厚度都很薄，所以纳米晶体的水动力学尺寸仅为5.7nm(图2a)。并且超小尺寸的功能化纳米晶体可能有益于其在生物成像和细胞标记中的应用。此外，高分辨率透射电子显微镜图像显示这些精氨酸官能化的纳米晶体保留着球形形态(图2b)并能显示出高质量的晶体结构(图2c)。并且图2d中的快速傅里叶变换(fft)模型证实所获得的laof:ce,tb@paa@arg是单晶体。所有这些结果表明已经成功地合成具有突出单分散性的超小纳米晶体。

此外，通过傅里叶变换红外(ftir)光谱(图2e)可以表征生长纳米晶体的表面官能团。在paa包覆后，位于1603和1715cm^-1的两个尖带分别与c-o和c＝o基团的伸缩振动相关，并且在2850-3485cm^-1范围内的宽吸收则归因于o-h振动，这表明生长纳米晶体表面覆盖有-cooh基团。至于laof：ce，tb@paa@arg的ft-ir光谱，在1640和1400cm^-1处、与conh振动相关的峰表明精氨酸成功通过酰胺键进行修饰。并且通过紫外吸收光谱(图2f)再次验证了该结果，即紫外吸收光谱中260和325nm处的特征吸收峰证明在nhs/edc化学反应之后形成了酰胺键。

需要特别说明的是：如图(3a)所示，laof:ce,tb@paa和laof:ce,tb@paa@arg呈现出一个窄双荧光光谱：在545nm处的绿色荧光发射峰和在585nm和620nm处的红色荧光发射峰。此外，laof:ce,tb@paa@arg的量子产率(qys)为40％，要远高于laof:ce,tb@paa的16％的量子产率，并且很可能是因为精氨酸修饰大大增强了晶体在水中的单分散性。值得注意的是，受益于精氨酸带来的更好的单分散性和来自镧的更高的电子传输能力，其40％的量子产率也远远超过我们以前gdof纳米晶体所含有的16％的量子产率。总而言之，与通常具有1％～10％量子产率的细胞成像量子点相比，laof:ce,tb@paa@arg表现出替代现有细胞染料的巨大性能优势。

上述laof:ce,tb@paa@arg纳米晶体(稀土染料)的应用如下：

将制得的laof:ce,tb@paa@arg纳米晶体按照5μg/ml-25μg/ml的浓度混入细胞培养液，细胞培养12-48小时后，利用共聚焦显微镜或者荧光显微镜观察被荧光标记的活细胞的细胞质和细胞核。

在ph7.4的类似生理环境的磷酸盐缓冲盐(pbs)溶液中，laof:ce,tb@paa@arg可以良好分散，并在254nm激发下可以发射出强黄绿色荧光(图3b)。在细胞成像方面(hepg2，一种人肝癌细胞)，laof：ce，tb@paa@arg可迅速穿透细胞基质，结合密集区域，例如核仁，并在24小时孵育后将相应区域染上色。而在相同的激发波长下，仅纳米晶体(绿色通道和红色通道，图3c)可以发射具有不同强度的两种不同的荧光(绿色和红色)。合并来自绿色通道和红色通道的图像，laof:ce,tb@paa@arg可以清晰地将核染成绿色同时将细胞质染成橙色(合并(红/绿)，图3c)。并且核的位置可以通过hoechst染色(合并(绿/红/hoechst)，图3c)来确认。

为了对活细胞进行染色成像，细胞毒性是细胞化学染色法中的最大障碍。因此，拥有优异荧光性能的laof:ce,tb@paa@arg进一步迫使我们研究其生物相容性。基于阿尔玛蓝(thermofisherscientific)测定法，我们选择具有不同剂量的laof:ce,tb@paa@arg和laof:ce,tb@paa来测试它们在两种细胞系(hepg2和l929)中的细胞毒性。如所预期的那样，在图4a中，没有精氨酸修饰的laof:ce,tb@paa对hepg2细胞系生长抑制呈现剂量依赖性。与之形成鲜明对比的是，该细胞系对laof:ce,tb@paa@arg(图4a)的处理有抗性，这表明精氨酸修饰显著增加了纳米晶体的生物相容性。并且在正常体细胞系l929中也发现了相似的结果，其中laof:ce,tb@paa@arg在200μg/ml到所使用的最高浓度之间都显示出对l929细胞具有完全抑制作用。以上这些数据显示了laof:ce,tb@paa@arg纳米晶体的体外生物相容性是令人满意的，表明它们在用于活细胞成像方面有巨大潜力。

为了研究laof:ce,tb@paa@arg和laof:ce,tb@paa的细胞成像性能，再次将hepg2细胞分别与25μg/ml的这两种纳米晶体孵育。在孵育24小时后，laof:ce,tb@paa@arg使细胞具有明亮的荧光，而通过laof:ce,tb@paa的成像是黯淡无光的(图5a)。在定量荧光强度(图5b)实验中，laof:ce,tb@paa@arg的荧光强度要超过laof:ce,tb@paa至少5倍。值得注意的是，这一差距要比它们之间相差2.5倍的qy要大，推测是由于精氨酸的存在增加了细胞渗透性。在我们的设计中，精氨酸功能化纳米晶体将通过类似于细胞穿透肽的作用方式，与细胞表面负电荷静电结合，或类似于通过渗透和膜裂解活性来诱导内吞和胞吞囊泡逃逸的方式来进入细胞中。同时，精氨酸增加了我们的纳米晶体与细胞外单层膜的结合并中和了阴离子脂质的表面电荷，促进跨膜电场的发展，所以精氨酸在细胞膜的脂质双层中可以形成瞬时孔。因此，精氨酸修饰将会导致染料对于活细胞具有更高的渗透性，这有利于形成更高分辨率的细胞成像，并降低染料的使用成本。

如今，商品化有机染料被广泛应用于生物学研究和临床诊断，但染料的光漂白现象妨碍了其在需要长时间持续的细胞成像中的应用。为了检测laof:ce,tb@paa@arg的抗光漂白性，使用商业化的活细胞荧光染料calceinam作为参照来比较纳米晶体的光漂白。正如所预料的那样，laof:ce,tb@paa@arg显示出更强的抗光漂白性。详细地说，在用calceinam和纳米晶体对细胞染色后立即观察，发现这两种物质都能在细胞形态成像中发出明亮的荧光。在暴露于可见光(400-800nm)8小时后，来自细胞内laof:ce,tb@paa@arg的绿色和红色荧光信号几乎完全保持其初始荧光强度(图6)，甚至在更亮的荧光中具有更高分辨率的核与细胞质图像依然有此特点。与此形成鲜明对比的是，calceinam的荧光在相同的条件下几乎消失不见。这些结果表明我们的功能化纳米晶体可以用于活细胞的细胞质和细胞核的长时间成像。

通过laof:ce,tb@paa@arg对纤维化细胞成像来区分纤维化细胞与正常细胞本发明合成的laof:ce,tb@paa@arg具有同时对癌细胞中的细胞质和细胞核成像的优越能力，借助其可以快速简便地区分细胞是否癌化。除了诊断癌症之外，对于临床医生和研究者来讲还存在另一个棘手的问题，即区分纤维化细胞与正常细胞。为了验证laof:ce,tb@paa@arg是否具有解决这个问题的能力，使用人支气管上皮细胞(beas-2b)细胞系作为纤维化的模型，同时用10ng/ml纤维化诱导剂tgf-β1处理。为了可视化观察正常细胞和纤维化细胞之间的不同形态，将用纤维化诱导剂孵育的beas-2b细胞作为实验组样品，而不使用诱导剂的则作为对照。在通过laof:ce,tb@paa@arg成像后，细胞形态被清晰地成像。如图7所示，对照组的细胞仍然保持着圆形或椭圆形轮廓的正常形状。与之形成鲜明对比的是，大多数纤维化细胞是纺锤形，但有些细胞甚至呈现出类似星状样的形状且伴随着丝状细胞质外围。受益于laof:ce,tb@paa@arg的优异的细胞成像性能，可以清楚地观察到这些细胞的形态学变化，从而为诊断纤维化细胞带来巨大的便利。

本发明提供的laof:ce,tb@paa@arg纳米颗粒，由于具有很好的水溶性与生物相容性，又具有很好的双光荧光特性，因此，可以进行活细胞形态标记。更由于其独特的红绿双光荧光特性，可以同时标记出细胞的细胞质和细胞核。同时，相对的传统细胞标记染料，本发明具有光稳定性强，完全没有荧光漂白和荧光衰减的问题。

本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已揭露的实施例并未限制本发明的范围。相反地，在不脱离本发明的精神和范围内所作的更动与润饰，均属本发明的专利保护范围。