本发明属于土壤调理剂，具体涉及一种含枯草芽孢杆菌及壳聚糖的土壤调理剂，应用在土壤板结、营养不良和病菌较多的田间。
背景技术：
在我国，土壤资源非常有限，相当比例的土壤因为成土原因或人为原因导致具有障碍因子。例如，侵蚀、质地不良、结构差、盐碱化、水分不足、肥力不足或病虫害多等。土壤调理剂可以分为天然来源，主要利用固体废弃物制得，例如高炉渣、城市污泥、秸秆、木屑、禽畜类粪便、发酵下脚料、鱼产品加工下脚料等；人工提取或合成的高分子聚合物，例如壳聚糖、腐殖酸、聚丙烯酸、聚乙二醇等高分子聚合物；生物制剂类，例如生物控制剂、菌根、微生物接种菌等。
本发明创新地将天然来源的虾蟹壳废料、壳聚糖和微生态制剂三方面结合起来，制成功能全面的土壤调理剂。
技术实现要素：
本发明的主要发明内容在于提供一种枯草芽孢杆菌降解虾蟹壳的微生态土壤调理剂及其固态培养基配方，为新型活菌土壤调理剂提供新的技术。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明中所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（bacillussubtulis）bsh0851，保藏日期为2009年12月13日，保藏单位是中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.3502。该菌株具有降解虾蟹壳几丁质作用和显著抑制病原菌的活性。
所述枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）为革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，常形成皱醭；需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，v-p阳性。
该菌株对各病原菌的抑菌率分别为西瓜炭疽病菌42.9%、烟草炭疽病菌72.3%、辣椒炭疽病菌31.3%、香蕉炭疽病菌41.7%、白菜炭疽病菌20.0%、黄瓜枯萎病菌43.5%、烟草赤星病菌28.6%、烟草灰霉病菌58.8%、康氏木霉菌38.0%。对植物病原细菌如：西瓜果斑病菌、辣椒疮痂病菌、烟草青枯病菌都有明显的抑菌作用。
表1.枯草芽孢杆菌bsh0851对部分细菌的生长抑制作用
注：“+”越多代表抑菌效果越明显
本发明含枯草芽孢杆菌及壳聚糖的土壤调理剂的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）种子液制备：将保藏于4℃冰箱的菌株取出，挑取一环菌接入100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基中，37℃，200r/min，培养1d；牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏2.5g，氯化钠2.5g，蛋白胨5g，琼脂粉7.5g，蒸馏水500ml，ph7.0～7.2；
（2）固体发酵：在虾蟹壳粉固体发酵培养基中接入培养1d的种子液20ml，混合均匀，37℃静置培养6d，得到所述土壤调理剂；虾蟹壳粉固体发酵培养基配方为：虾蟹壳粉50g，水26ml，谷皮量9g，麦麸皮20g。
所制得的含枯草芽孢杆菌及壳聚糖的土壤调理剂中含有壳聚糖12mg/g，孢子或活菌含量在5×108个/g。
本发明的有益效果如下：
本发明的土壤调理剂具有以下功效：（1）bsh0851枯草芽孢杆菌具有显著抑制病原菌的活性。（2）虾蟹壳具有丰富的矿物质和土壤疏松性。据测定烘干虾蟹壳中的营养成分：钾0.65%、钠1.22%、镁0.8%、磷1.67%、碳酸钙25.8%、粗蛋白17.1%。（3）壳聚糖具有抑菌功能。
总的来说，该土壤调理剂具有对多种植物病原真菌和病原细菌具有显著抑制作用，具有疏松土壤和优化土壤微生态作用、能显著促进作物生长和减少植物病害。
具体实施方式：
土壤调理剂制备
本发明以壳聚糖产量为评判指标，以饲料含枯草芽孢杆菌量作为辅助指标，用于确定固态培养基配方。
以50g的虾蟹壳粉为基础，种子液添加量为20ml。选取培养蛋白胨、麦麸皮、硫酸铵、谷皮、葡萄糖、水作为待筛选的发酵条件，以发酵产物壳聚糖含量和枯草芽孢杆菌量为响应指标，采用plackett-burman试验设计，得到水、麦麸皮和谷皮这3个因子对壳聚糖含量和菌量具有同样显著的影响，且影响依次为水＞麦麸皮＞谷皮，采用最陡爬坡试验确定各因素水平范围后，进一步利用box-behnken试验设计以下案例，见表2。
壳聚糖含量的测定
准确称取1g的虾壳粉固体培养基，用30ml1%的醋酸浸泡2h然后用1%的醋酸定容至100ml制备成样品溶液。然后在试管中分别加入0.5ml的锌试剂操作液、3.25ml醋酸—醋酸钠缓冲液、1.25ml的样品溶液，摇匀放置10min，以蒸馏水对照在465nm处测吸光度，并制作壳聚糖标准曲线计算样品中壳聚糖含量。
表2固态发酵培养基设计
根据案例数据分析得到二次多项式回归方程为：y（壳聚糖含量）=11.539-0.474水+1.028谷皮-2.036水*水-1.349水*麦麸皮，模型拟合度达91.19%，p＜0.05，说明该模型的拟合较好，误差较小。
由此设计案例16，得到最佳发酵条件为：50g虾蟹壳粉，水26ml，谷皮量9g，麦麸皮20g，壳聚糖含量达到最大值12.4mg/g，菌量5×108个/g。
土壤调理剂应用
烟草青枯病盆栽防治试验：用细菌悬浮液配制带菌土，在带菌土中种植伤根的三叶期烟苗。20盆施用土壤调理剂（20g/盆），20盆不施药为对照。50d后调查防治效果：处理区烟草青枯病的明显减少，烟叶产量和根系明显增加(见表3)。
表3.枯草芽孢杆菌壳聚糖土壤调理剂防治烟草青枯病盆栽试验结果
烟草移栽期选择历年烟草青枯病重病田进行田间防治试验。每种药剂设3个重复，每个小区面积30㎡，小区分布为随机排列，要求各小区种植烟株大小均匀，于移栽期施药。枯草芽胞杆菌壳聚糖土壤调理剂按60kg/亩（50g/株）采用穴施，并与根周围土壤拌匀后覆盖土壤；72%农用硫酸链霉素2000倍液移栽后淋茎灌根用药量250ml/株。不施药为对照。试验结果表明枯草芽胞杆菌壳聚糖土壤调理剂对烟草青枯病有较好防治效果，并优于72%农用硫酸链霉素(表4)。
表4.枯草芽孢杆菌壳聚糖土壤调理剂防治烟草青枯病田间试验结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。