核酸稳定的荧光银纳米团簇、制备方法及其在毒素检测的应用与流程

本发明属于纳米复合材料研究领域，特别涉及一种利用特定的核酸序列为模板制备稳定的具有荧光的银纳米团簇复合材料的制备方法，这种材料结合二硫化钨类似于石墨烯的纳米二维层状结构的性质用于新型的对多种毒素同时检测的荧光型生物传感器，所述的核酸稳定的银纳米团簇可记作AgNCs。

背景技术：

动物饲料和人食物中的霉菌毒素对动物和人体的健康有很大的危害，进而引发了全球人民对霉菌毒素检测的高度关注。赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1是最为普遍的两种的霉菌毒素。这两种毒素在天然食物（如谷类、豆类、干果、咖啡等）中最为多见，毒性也最强。现有技术中，法定的检测赭曲霉毒素A的方法有薄层色谱分析荧光检测（TLC-FD）和高效液相色谱荧光分析法(HPLC-FD)。传统定量检测黄曲霉毒素B1的方法有色谱分析法、液相色谱-质谱法等。然而，这些方法需要高端的设备和复杂精细的操作方法。

近年来，又发展了酶联免疫吸附测定（ELISA）、电化学分析、表面等离子体共振（SPR)等方法用来检测食物中含有的赭曲霉毒素。尽管这些方法比较受欢迎，但这些方法都需要一个稳定的抗体来源，而且耗时还比较久、花费也比较高。

因此，发展一种简单快速、低消耗、灵敏度高的检测方法来检测食品中赭曲霉毒素A或黄曲霉毒素B1的含量已迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种核酸稳定的荧光银纳米团簇的制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种核酸稳定的荧光银纳米团簇。

本发明的第三个目的是提供一种基于所述的具有荧光的银纳米团簇复合材料在毒素检测的生物传感器的应用方法，该方法的选择性好，灵敏度高，成本低。

为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是信号探针与硝酸银在缓冲液体系中混合，以硼氢化钠为催化剂，避光的条件下反应合成核酸稳定的荧光银纳米团簇，所述的信号探针P6，

所述信号探针P6的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

进一步设置是信号探针的最终浓度为1.5μM。

进一步设置是该荧光银纳米团簇的荧光波段为近红外光波段。

本发明的第二个目的是提供一种核酸稳定的荧光银纳米团簇作为荧光探针分析食品中的毒素的方法，

（1）将所述的核酸稳定的荧光银纳米团簇在缓冲液体系下，加入二硫化钨、以及分别加入用于标定的多组浓度的毒素溶液，待反应完毕，分别检测反应后体系的荧光强度，获得该荧光强度与用于标定的多组毒素溶液对数之间在浓度检测区间的线性比例关系；

（2）将所述的核酸稳定的荧光银纳米团簇在缓冲液体系下，加入二硫化钨，以及加入待检测的AFB1毒素溶液，根据步骤（1）的线性比例关系确定待检测的毒素溶液的浓度。

进一步设置是所述的浓度检测区间为50ng/mL到1000ng/mL。

本发明还提供一种核酸稳定的荧光银纳米团簇混合体系的制备方法，将2种信号探针与硝酸银在缓冲液体系中混合，以硼氢化钠为催化剂，避光的条件下反应合成核酸稳定的荧光银纳米团簇混合体系，所述的信号探针包括有信号探针P5和信号探针P6，

所述探针P5的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

所述探针P6的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明还提供一种核酸稳定的荧光银纳米团簇混合体系作为荧光探针分析食品中的毒素的方法，

（1）将所述的核酸稳定的荧光银纳米团簇混合体系在缓冲液体系中，加入二硫化钨、以及分别加入用于标定的多组浓度的毒素溶液，待反应完毕，分别检测反应后体系的荧光强度，获得该荧光强度与用于标定的多组毒素溶液对数之间在浓度检测区间的线性比例关系；

（2）将所述的核酸稳定的荧光银纳米团簇混合体系在缓冲液体系下，加入二硫化钨，以及加入待检测的毒素溶液，所述的毒素溶液为OTA毒素和AFB1毒素的混合溶液，根据步骤（1）的线性比例关系同时检测OTA毒素和AFB1毒素的浓度。

本发明的创新机理是：

（1）设计两种类型的核酸稳定的银纳米团簇（AgNCs）：

一种是发红光的AgNCs (616nm)，第二种是发近红外光的AgNCs（775nm）。

由于胞嘧啶丰富的核酸序列稳定的AgNCs不能很好的吸附在WS2上，因此要连接一单链DNA序列在DNA稳定的AgNCs上，使其能够吸附在WS2上并淬灭AgNCs发射的荧光。连接在DNA稳定的AgNCs上的序列可以是毒素的适配体序列，本发明中分别为OTA毒素适配体链和AFB1毒素适配体链。

如表1所示，探针P1序列能够与银离子作用，在还原剂硼氢化钠的存在下，还原成银纳米团簇。当激发波长为606nm时，在670nm左右有一个荧光吸收峰。探针P2序列也能够与银离子作用，在还原剂硼氢化钠的存在下，还原成银纳米团簇，当激发波长为763nm时，在820nm左右有一个荧光吸收峰。探针P3为OTA的核酸适配体序列，探针P4为AFB1的核酸适配体序列。探针5序列由P1序列和OTA的适配体序列组成，并能够与银离子作用，在还原剂硼氢化钠的存在下，还原成银纳米团簇，当激发波长为530nm时，在615nm左右有一个荧光吸收峰。探针6序列由P2序列和AFB1的适配体序列组成，也能够与银离子作用，在还原剂硼氢化钠的存在下，还原成银纳米团簇，当激发波长为730nm时，在770nm左右有一个荧光吸收峰。

表1.方法中合成的核酸序列（5’→3’）

（2）DNA稳定的AgNCs的制备方法：

制备具有荧光的银纳米颗粒：体系中单链浓度为1.5μM。在总反应体系中，加入10mM PBS缓冲液，事先准备好的合成的AgNCs所需的信号探针，适量浓度的硝酸银溶液，混匀30s后静止15分钟，再加入适量浓度的硼氢化钠溶液混匀，避光的条件下反应12小时后，放在冰箱里待用。

所述合成的AgNCs所需的信号探针分别为：表1中信号探针5和信号探针6。

本发明核酸稳定的AgNCs作为荧光探针分析食品中的毒素：

在总反应的体系中，加入20μL本发明所制得的AgNCs上述溶液、100μL的缓冲溶液、适量的WS2、适量的灭菌水、不同浓度的毒素溶液，50min后测荧光。在本发明中AgNCs在体系中的最终浓度为100nM。

本发明的有益成果在于：

（1）设计并制备的核酸稳定的发荧光的AgNCs，操作简单，易得；

（2）制备的核酸稳定的发荧光的AgNCs结合二硫化钨类似于石墨烯纳米二维层状结构的性质，实现对多种毒素的灵敏检测。

（3）制备的核酸稳定的发荧光的AgNCs结合二硫化钨类似于石墨烯纳米二维层状结构的性质，发展的新型传感器，无需标记，操作简单，耗时短，灵敏度高。

综上所述：一方面本发明提供的核酸稳定的发荧光的AgNCs的制备方法，操作简单，易得，室温下即可完成，易于大规模生产；另一方面，将制得的核酸稳定的发荧光的AgNCs结合二硫化钨应用于检测毒素的生物传感器，可以实现对多种毒素的灵敏检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1：本发明制备核酸稳定的AgNCs结合二硫化钨应用于多种毒素同时检测的原理图；

图2：本发明实施例1制得的发红外光的AgNCs结合二硫化钨应用于生物传感器中，在不同的OTA浓度时，荧光强度的变化；

图3：本发明实施例2制得的发近红外光的AgNCs结合二硫化钨应用于生物传感器中，在不同的AFB1浓度时，荧光强度的变化；

图4：本发明实施例3中，发红外光的AgNCs和发近红外光的AgNCs结合二硫化钨同时应用于生物传感器中，对OTA和AFB1同时检测时的荧光光谱图，曲线a和曲线b分别对应的发红外光的AgNCs和发近红外光的AgNCs。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：发红外光的AgNCs的制备及在生物传感器中的应用

（1）合成DNA稳定的发红外光的AgNCs

制备具有荧光的银纳米颗粒：体系中单链浓度为1.5μM。在总反应体系中，加入10mM PBS缓冲液，事先准备好的合成的发红外光的AgNCs所需的信号探针P5，适量浓度的硝酸银溶液，混匀30s后静止15分钟，再加入适量浓度的硼氢化钠溶液混匀，避光的条件下反应12小时后，放在冰箱里待用。

（2）采用DNA稳定的发红外光的AgNCs作为荧光探针，分析食品中的OTA毒素

在总反应的体系中，加入20μL发红外光的AgNCs上述溶液、100μL的缓冲溶液、适量的WS2、适量的灭菌水、不同浓度的OTA毒素溶液，50min后测荧光。

图2为本实施例制得的发红外光的AgNCs结合二硫化钨应用于生物传感器中，在不同的OTA浓度时，荧光强度的变化，从图中可以看出，随着溶液中OTA含量的增加，荧光强度逐渐恢复。当OTA的浓度为1000ng/mL时，荧光强度基本恢复到探针5合成的发红光的AgNCs所具有的荧光强度。当OTA浓度在10ng/mL到200ng/mL 之间时，荧光强度与OTA浓度的对数呈线性关系，并可以由此计算出最低检测下限为0.5ng/mL。

实施例2：发近红外光的AgNCs的制备及在生物传感器中的应用

（1）合成DNA稳定的发近红外光的AgNCs

制备具有荧光的银纳米颗粒：体系中单链浓度为1.5μM。在总反应体系中，加入10mM PBS缓冲液，事先准备好的合成的发近红外光的AgNCs所需的信号探针P5，适量浓度的硝酸银溶液，混匀30s后静止15分钟，再加入适量浓度的硼氢化钠溶液混匀，避光的条件下反应12小时后，放在冰箱里待用。

（2）采用DNA稳定的发近红外光的AgNCs作为荧光探针，分析食品中的AFB1毒素

在总反应的体系中，加入20μL发近红外光的AgNCs上述溶液、100μL的缓冲溶液、适量的WS2、适量的灭菌水、不同浓度的AFB1毒素溶液，50min后测荧光。

图3为本实施例制得的发近红外光的AgNCs结合二硫化钨应用于生物传感器中，在不同的AFB1浓度时，荧光强度的变化，从图中可以看出，随着溶液中AFB1含量的增加，荧光强度逐渐恢复。当AFB1的浓度为1000ng/mL时，荧光强度基本恢复到探针6合成的发近红外光的AgNCs所具有的荧光强度。当AFB1浓度在50ng/mL到1000ng/mL 之间时，荧光强度与OTA浓度的对数呈线性关系，并可以由此计算出最低检测下限为0.5ng/mL。

实施例3：发红外光的AgNCs和发近红外光的AgNCs同时应用于生物传感器

（1）合成DNA稳定的AgNCs

制备发近红外光的银纳米颗粒：体系中单链浓度为1.5μM。在总反应体系中，加入10mM PBS缓冲液，事先准备好的合成的发近红外光的AgNCs所需的信号探针P6，适量浓度的硝酸银溶液，混匀30s后静止15分钟，再加入适量浓度的硼氢化钠溶液混匀，避光的条件下反应12小时后，放在冰箱里待用。

制备发红外光的银纳米颗粒：体系中单链浓度为1.5μM。在总反应体系中，加入10mM PBS缓冲液，事先准备好的合成的发红外光的AgNCs所需的信号探针P5，适量浓度的硝酸银溶液，混匀30s后静止15分钟，再加入适量浓度的硼氢化钠溶液混匀，避光的条件下反应12小时后，放在冰箱里待用。

（2）采用DNA稳定的发近红外光的AgNCs和发红外光的AgNCs作为荧光探针，同时分析食品中的OTA毒素和AFB1毒素

在总反应的体系中，加入20μL发近红外光的AgNCs上述溶液和20μL发红外光的AgNCs上述溶液、100μL的缓冲溶液、适量的WS2、适量的灭菌水、OTA毒素，AFB1毒素，50min后测荧光。（OTA和AFB1的最终浓度均为200ng/mL）

图4为本实施例制得的发近红外光的AgNCs和发红外光的AgNCs，并且结合二硫化钨应用于生物传感器中，在AFB1和OTA两种毒素同时存在时，并且浓度均为200ng/mL时，荧光强度的变化。从图中可以看出，当目标毒素OTA和AFB1都存在时，由于两种毒素都可以分别与对应的AgNCs上的适配体序列特异性结合而使其从WS2上脱附下来，所以在615nm和775nm处都可以测得很强的荧光信号。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 温州大学

<120> 一种核酸稳定的荧光银纳米团簇、制备方法及其在毒素检测的应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 多核苷酸

<400> 1

ACCCGAACCT GGGCTACCACCC 22

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 多核苷酸

<400> 2

CCCACCCACC CTCCCA 16

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 多核苷酸

<400> 3

TTAATCCCCA AAGATCGGGT GTGGGTGGCG TAAAGGGAGC ATCGGAC 47

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 多核苷酸

<400> 4

GTTGGGCACG TGTTGTCTCT CTGTGTCTCG TGCCCTTCGC TAGGCCC 47

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 多核苷酸

<400> 5

ACCCGAACCT GGGCTACCAC CCTTAATCCC CAAAGATCGG GTGTGGGTGG CGTAAAGGGA 60

GCATCGGAC 69

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 多核苷酸

<400> 6

CCCACCCACC CTCCCAGTTG GGCACGTGTT GTCTCTCTGT GTCTCGTGCC CTTCGCTAGG 60

CCC 63