一种生物纳米复合材料及其合成方法和应用与流程

本发明属于纳米材料分析检测技术领域，涉及一种生物纳米复合材料及其合成方法和应用。

背景技术：

帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，最早由詹姆斯帕金森于1817年提出，是继阿尔茨海默病后人类第二常见的神经退行性疾病。其病因和发病机制尚未明确，病理主要有，中脑黑质多巴胺神经元变性死亡、纹状体显著性减少、黑质神经元细胞质中出现路易小体等。α-突触核蛋白是路易小体的主要成分，其位于神经元突触前末端，是由140个氨基酸组成的蛋白质，它的突变、聚集和过度积累与包括帕金森病在内的一系列神经退行性疾病密切相关。

目前可用于监测细胞中蛋白质聚集体积累的技术仍存在许多限制。到目前为止，科研工作者们已经建立了几种分析α-突触核蛋白的方法，比如透射电子显微镜，聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹，但这些方法耗时且不适合高量应用。基于荧光的技术也被广泛应用于监测α-突触核蛋白聚集，如绿色荧光蛋白和小荧光团(双砷标记试剂，alexa染料和硫磺素t等)。但这些荧光探针存在小斯托克斯位移和绿色荧光发射的缺点，这与其他细胞组分的固有荧光重叠。此外，体外实验已经证明，fe³⁺可以诱导α-突触核蛋白低聚物的形成，而且在帕金森病患者的脑组织黑质中也观察到的神经黑色素颗粒中fe³⁺浓度较高。然而，尚未明确报道与帕金森病相关的fe³⁺和α-突触核蛋白之间的相互作用。

技术实现要素：

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种多功能生物纳米复合材料，实现了在体外和体内对铁离子和α-突触核蛋白聚集体的双光子荧光寿命检测和成像，首次解析了帕金森病相关的铁离子和α-突触核蛋白的相互作用关系，并用于细胞及鼠脑切片成像，构建了化疗与光热疗的诊疗一体化平台，对于研究帕金森病的治疗和诊断具有重要意义。

本发明提供了一种铁离子双光子荧光探针的合成方法，所述方法包括以下步骤：

在碱的水溶液中，四丁基硫酸氢铵(tbahs)、4-二乙基氨基苯甲醛和2-氨基-4,6-二甲基嘧啶进行回流反应，得到如式(a)所示的铁离子双光子荧光探针，反应过程如反应式(i)所示：

本发明中，所述四丁基硫酸氢铵、4-二乙基氨基苯甲醛和2-氨基-4,6-二甲基嘧啶的摩尔浓度比为(0.5-2)：(20-25)：(8-12)；优选地，为1：22：10。

本发明中，所述回流反应的温度为100℃-150℃；优选地，为120℃。

本发明中，所述回流反应的时间为1h-4h；优选地，为2h。

本发明中，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡等中的一种或多种；优选地，为氢氧化钠。

本发明中，所述铁离子双光子荧光探针为d-π-a-π-d构型(d表示电子给体，a表示电子受体)，为高双光子吸收截面的比率型荧光探针。

其中，在反应结束后，还可以包括以下步骤，对产物进行纯化：将装置冷却到室温，旋蒸得到粗产物，过柱(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)即可得到纯物质。

本发明中采用了键能量转移策略来设计和合成新型双光子荧光探针。具体地，该铁离子双光子荧光探针是基于嘧啶骨架(d-π-a-结构衍生物)的双光子分子，其在位置2和4中的两个n原子，能够特异性地结合铁离子发生荧光猝灭。为了获得更大的双光子吸收截面值，本发明使用烯烃基团连接嘧啶核(电子受体)和苯基(电子给体)以构成d-π-a-π-d四极型分子。该d-π-a-π-d分子中的甲基和苯基为电子提供了强大的供给能力，供体与受体之间的长距离产生了有效的电荷转移，导致探针分子的双光子截面值很大。在800nm光激发下，探针的最大双光子值估计为593gm-687gm。本发明采用“回流反应”一步法合成铁离子双光子荧光探针，与传统的铁离子荧光探针相比，具有反应条件较为温和、操作简单方便和原料成本低等优点。

在本发明的一个具体实施方式中，所述铁离子双光子荧光探针的合成方法包括以下步骤：在120℃温度条件下，将1mmol四丁基硫酸氢铵，22mmol4-二乙基氨基苯甲醛和10mmol2-氨基-4,6-二甲基嘧啶在50ml5mnaoh溶液中回流2小时。通过旋蒸得到橙色产物，并通过柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)得到纯物质，反应过程如反应式(i')所示：

本发明还提供了由上所述方法制备得到的铁离子双光子荧光探针，其中，所述铁离子双光子荧光探针为d-π-a-π-d构型(d表示电子给体，a表示电子受体)，为高双光子吸收截面的比率型荧光探针。

本发明还提供了一种α-突触核蛋白双光子荧光探针的合成方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在第一有机溶剂中，三氯化钌，邻二氮菲和氯化锂进行回流反应，得到二(1,10-邻菲咯啉)二氯化钌(ru(phen)2cl2)。

(2)然后在甲醇和水的混合溶液中，二(1,10-邻菲咯啉)二氯化钌(ru(phen)2cl2)和二吡啶并[3,2-a:2'.3'-c]吩嗪(dppz)进行回流反应，得到如式(b)所示的α-突触核蛋白双光子荧光探针，反应过程如反应式(ii)所示：

步骤(1)中，所述第一有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等中的一种或多种；优选地，为n,n-二甲基甲酰胺。

步骤(1)中，所述三氯化钌，邻二氮菲和氯化锂摩尔浓度比为(10-20)：(25-35)：(0.5-1.5)；优选地，为15：30：1。

步骤(1)中，所述回流反应的温度为150℃-180℃；优选地，为170℃。

步骤(1)中，所述回流反应的时间为6h-12h；优选地，为8h。

本发明在步骤(1)回流反应之后，还包括向反应混合物中加入第二有机溶剂和冷却过夜，其中，加入第二有机溶剂的目的为溶解杂质，冷却过夜的目的为降低溶解度使得产物析出。

其中，所述有机溶剂为丙酮、乙醇、异丙醇等中的一种或多种；优选地，为丙酮。

其中，所述冷却的温度为0℃-10℃；优选地，为4℃。

步骤(2)中，所述二(1,10-邻菲咯啉)二氯化钌(ru(phen)2cl2)和二吡啶并[3,2-a:2'.3'-c]吩嗪(dppz)的摩尔浓度比为(1-2)：(1-2)；优选地，为1.2：1。

步骤(2)中，所述甲醇和水的体积比为(1-2)：(1-2)；优选地，为1：1。

步骤(2)中，所述回流反应的温度为80℃-110℃；优选地，为100℃。

步骤(2)中，所述回流反应的时间为3h-5h；优选地，为4h。

本发明在步骤(2)回流反应后，还包括冷却，然后加入六氟磷酸盐使产物从溶液中沉淀出来的步骤。

其中，所述六氟磷酸盐为六氟磷酸铵、六氟磷酸钠、六氟磷酸钾等中的一种或多种；优选地，为六氟磷酸铵。

本发明，在整个反应结束后，还可以包括以下步骤，对产物进行纯化：将装置冷却到室温，加入六氟磷酸铵使产物从溶液中沉淀出来并过滤得到粗产物。通过柱色谱(二氯甲烷：乙腈＝4：1)和重结晶(乙醇：水＝90:10)纯化得到红橙色晶体。

本发明中以二吡啶吩嗪衍生物的思路来设计和合成新型双光子荧光探针。具体地，该α-突触核蛋白双光子荧光探针是钌(ii)配合物，能够特异性地结合用纤维化的α-突触核蛋白或检测细胞内蛋白质的聚集。本发明经过改良合成路线，该α-突触核蛋白双光子荧光探针荧光发射波长红移，并获得了大的斯托克斯位移(大于200nm)和高光稳定性(大于95％)，利于研究细胞内各种蛋白质的聚集研究。

在本发明一个具体实施方式中，所述α-突触核蛋白双光子荧光探针的合成方法包括以下步骤：在170℃温度条件下，将56mmol三氯化钌，112mmol邻二氮菲和3.7mmol氯化锂在25mldmf中回流8小时。然后将丙酮加入到反应混合物中，将其在4℃下冷却过夜，产物ru(phen)2cl2无需进一步纯化即可使用。在100℃温度条件下，12mmolru(phen)2cl2和10mmol二吡啶并[3,2-a:2'.3'-c]吩嗪在1：1的甲醇水溶液中回流4小时。将装置冷却到室温，加入六氟磷酸铵使产物从溶液中沉淀出来并过滤得到粗产物。通过柱色谱(二氯甲烷：乙腈＝4：1)和重结晶(乙醇：水＝90:10)纯化得到红橙色晶体。

本发明还提供了一种多功能生物纳米复合材料的合成方法，所述方法包括以下步骤：

在缓冲溶液中，首先，将本发明上述方法制备得到的铁离子双光子荧光探针通过酰胺键连接到硫化铜纳米球表面，然后将本发明上述方法制备得到的α-突触核蛋白双光子荧光探针通过静电吸附连接到硫化铜纳米球表面，最后将药物装载到硫化铜纳米球内并以dna纳米门封孔，从而合成了多功能生物纳米复合材料。

本发明中，所述药物为雷帕霉素、环孢菌素、他克莫司等中的一种或多种；优选地，为雷帕霉素。

本发明中，所述缓冲溶液优选为pbs缓冲溶液；所述缓冲溶液的ph为6.0-8.0；优选地，为7.4。

本发明中，所述铁离子双光子荧光探针和硫化铜纳米球的浓度比为(0.5-1)：(9-11)(m:g/l)；优选地，为1：10。

本发明中，所述α-突触核蛋白双光子荧光探针和硫化铜纳米球的浓度比为(0.5-1)：(9-11)(m:g/l)；优选地，为1：10。

本发明中“铁离子双光子荧光探针通过酰胺键连接到硫化铜纳米球表面”的具体步骤为：先将硫化铜纳米球分散在ph＝7.4的pbs缓冲液中，使得其浓度为1mg/ml。然后将20μg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到10ml上述溶液中并室温下搅拌1小时，然后加入20μgn-羟基琥珀酰亚胺并在室温下搅拌1小时，之后，再加入100μl浓度为10mol/l的铁离子双光子荧光探针，搅拌过夜。然后以800rpm离心10min收集产物，去离子水离心重分散洗涤2次，最后重新分散在10mlph＝7.4的pbs缓冲液中。然后将100μl浓度为10mol/l的α-突触核蛋白双光子荧光探针加入到上述溶液中，并在室温下搅拌过夜，以800rpm离心10min收集产物，去离子水离心重分散洗涤2次，最后重新分散在10mlph＝7.4的pbs缓冲液中。

本发明中所述“dna纳米门”中的dna的基因序列如seqidno.1-3所示：

sub-dna-7：5'-hs-ttttttgagcgactcactatr(a)ggaagagatg(seqidno.1)

其中，seqidno.1为嵌有rna的一段dna序列，中间嵌入的rna用r()表示，r(a)中的a是指rna的腺嘌呤。

partzymea-7：tggaagcaacaaaatcacggtcgaaatagtgagtcgctc(seqidno.2)

partzymeb-7：catctcttctccgagcctagtcttcca(seqidno.3)

本发明中所述硫化铜纳米颗粒可以参考(dengx,lik,caix,etal.ahollow-structuredcus@cu2s@aunanohybrid:synergisticallyenhancedphotothermalefficiencyandphotoswitchabletargetingeffectforcancertheranostics[j].advancedmaterials,2017,29(36):1701266.)的方法进行制备，具体地，包括以下步骤：通过使用聚乙烯吡咯烷酮作为封端剂将水合肼加入到硫酸铜和氢氧化钠溶液中制备氧化亚铜纳米球，然后以此为模板在室温下通过离子交换过程合成亲水性多孔中空硫化铜纳米颗粒；最后用邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯改变其电性为正电。

本发明采用了逐步组装法来合成多功能生物纳米复合材料。具体地，首先通过一锅法合成了尺寸均一的硫化铜多孔中空纳米粒子，然后将铁离子双光子荧光探针、α-突触核蛋白双光子荧光探针、药物雷帕霉素和dna纳米门通过化学键和静电吸附逐步组装的到硫化铜纳米粒子表面。该方法具有反应条件温和、操作简单和原料利用率高(84.2％-87.5％)等优点。

在本发明的一个具体实施方式中，所述多功能生物纳米复合材料的合成方法包括以下步骤：

在ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，5ml10μg/ml的硫化铜纳米球中加入20μg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐搅拌2小时，然后加入20μgn-羟基琥珀酰亚胺搅拌半小时，之后，在搅拌下将100μl50μg/ml铁离子双光子荧光探针加入混合物中过夜。通过离心收集产物并通过用去离子水洗涤次数来纯化，然后重悬于5mlph＝7.4的pbs缓冲溶液中。最后，将100μl50μg/mlα-突触核蛋白双光子荧光探针加入到溶液中并在室温下搅拌过夜。通过离心收集所得产物，并通过用去离子水洗涤次数来纯化，然后重悬于5mlph＝7.4的pbs缓冲溶液中。最后，将药物雷帕霉素装载到硫化铜纳米球里并以dna纳米门封孔，从而构建了一个多功能生物纳米复合材料。

本发明还提供了由上述方法制备得到的多功能生物纳米复合材料。

本发明还提供了所述多功能生物纳米复合材料在体外通过双光子荧光寿命成像检测fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体中的应用。

本发明还提供了所述多功能生物纳米复合材料在细胞内通过双光子荧光寿命成像解析fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体中的应用。

本发明还提供了所述多功能生物纳米复合材料在通过双光子荧光成像检测α-突触核蛋白聚集体治疗帕金森病、阿尔兹海默症、突触核蛋白病等中的应用。

本发明还提供了所述多功能生物纳米复合材料作为载体在治疗和诊断帕金森病、阿尔兹海默症、突触核蛋白病等中的应用。

本发明利用fe³⁺可以特异性地和铁离子双光子荧光探针中嘧啶基团2和4位的两个n原子结合的特点，将铁离子双光子荧光探针与不同浓度的fe³⁺反应，从而得到荧光寿命衰减曲线及其线性范围，进而可以来检测fe³⁺浓度的变化，其中，所述荧光寿命衰减曲线是根据荧光成像的平均寿命的衰减所作的曲线。

本发明还提供了一种通过铁离子双光子荧光寿命成像在体外检测fe³⁺的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将式(a)所示的铁离子双光子荧光探针与fe³⁺发生络合反应；

(2)测定荧光寿命，通过测定所得的荧光寿命和fe³⁺的关系，来测定fe³⁺含量。

其中，步骤(1)中，所述络合反应的温度为室温；优选地，为25℃。

其中，步骤(1)中，所述络合反应的时间为4-20s；优选地，为5s。

其中，步骤(1)中，所述络合反应优选在常压下进行。

其中，所述方法适用的铁离子双光子荧光探针的浓度为40-80μm；优选地，为50μm。

其中，所述方法适用检测的fe³⁺的线性范围为0-10μm；优选地，为1-10μm。

其中，所述方法适用检测的fe³⁺的最低检测限为0.66μm。

其中，所述fe³⁺来自细胞裂解液；所述细胞包括：shsy-5y细胞、hela细胞、pc12细胞、巨噬细胞等中的一种或多种；优选地，为shsy-5y细胞。

本发明合成的铁离子双光子荧光探针的嘧啶基团在2和4位具有两个n原子，能够和金属阳离子进行特异性配位。此外，铁离子双光子荧光探针的紫外可见吸收光谱表明其在470nm附近有吸收带，这可能是由配体为中心的π-π*电子跃迁引起的。铁离子在吸收光谱中显示出更多的干扰，导致了探针荧光猝灭和荧光寿命的降低，表明其对铁离子具有高选择性。此外，本发明采用800nm双光子激发检测分子荧光寿命，相较于其他方法具有不受光强、浓度、光漂白、细胞自体荧光等影响；定量准确分析；能够实现生物体内检测；组织穿透性强，可用于活体成像等优点。

在本发明的一个具体实施方式中，所述铁离子双光子荧光寿命成像在体外检测fe³⁺的方法，包括：

(1)制作标准曲线：

将式(a)50μm的铁离子双光子荧光探针与含有不同浓度的fe³⁺(0,2,4,6,8,10,20,30,40μm)的细胞裂解液在常温常压下发生反应，记录不同浓度下的荧光寿命衰减曲线，然后做出各组荧光寿命和fe³⁺浓度的关系曲线，得出线性范围为0-10μm。

(2)测定样品中fe³⁺含量

将式(a)50μm的铁离子双光子荧光探针与样品中fe³⁺在常温常压下发生反应，测定荧光寿命，并根据fe³⁺浓度和荧光寿命的关系，计算样品中fe³⁺含量。

本发明根据上述方法得到的铁离子双光子荧光寿命衰减曲线及其线性范围，可以用于体外检测fe³⁺浓度的变化。

本发明利用fe³⁺可以特异性地和铁离子双光子荧光探针中嘧啶基团2和4位的两个n原子结合的特点，将铁离子双光子荧光探针与不同浓度的fe³⁺反应，从而得到荧光寿命衰减曲线及其线性范围，进而可以来检测fe³⁺浓度的变化，其中，所述荧光寿命衰减曲线是根据荧光成像的平均寿命的衰减所作的曲线。

本发明还提供了一种通过α-突触核蛋白双光子荧光寿命成像在体外检测α-突触核蛋白聚集体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将式(b)所示的α-突触核蛋白荧光探针与α-突触核蛋白聚集体发生反应；

(2)测定荧光寿命，通过测定所得的荧光寿命和α-突触核蛋白聚集体的关系，来测定α-突触核蛋白聚集体含量。

其中，步骤(1)中，所述反应的温度为室温；优选地，为25℃。

其中，步骤(1)中，所述反应的时间为4-20s；优选地，为10s。

其中，步骤(1)中，所述反应优选在常压下进行。

其中，本发明式(b)所示的α-突触核蛋白荧光探针与α-突触核蛋白聚集体发生反应是指α-突触核蛋白荧光探针官能团嵌入纤维沟堑中。

其中，所述方法适用的α-突触核蛋白双光子荧光探针浓度为40-80μm；优选地，为50μm。

其中，所述方法适用检测的α-突触核蛋白聚集体的线性范围为0-10μm；优选地，为2-10μm。

其中，所述方法适用检测的α-突触核蛋白聚集体的最低检测限为0.82μm。

本发明中合成的α-突触核蛋白荧光探针是“光开关分子”。具体地，在水溶液中，其处于未激发状态，几乎不发射荧光。在α-突触核蛋白原纤维框架存在下，其与主沟相互作用，改变了配体所感受到的微环境的极性，这有利于发光状态和荧光寿命的增加。在单体α-突触核蛋白存在下，其几乎不发射荧光并且荧光寿命不变，是由于探针和α-突触核蛋白单体之间的相互作用弱，因此该探针能够用于特异性地检测α-突触核蛋白聚集体。此外，本发明采用800nm双光子激发检测分子荧光寿命，相较于其他方法具有不受光强、浓度、光漂白、细胞自体荧光等影响；定量准确分析；能够实现生物体内检测；组织穿透性强，可用于活体成像等优点。

在本发明的一个具体实施方式中，所述双光子荧光寿命成像在体外检测α-突触核蛋白聚集体的方法，包括：

(1)制作标准曲线：

将式(b)50μm的α-突触核蛋白双光子荧光探针与含有不同浓度的α-突触核蛋白聚集体(0,2,4,6,8,10,12,14，16μm)在常温常压下发生反应，记录不同浓度下的荧光寿命衰减曲线，然后做出各组荧光寿命和α-突触核蛋白聚集体浓度的关系曲线，得出线性范围为0-10μm。

(2)测定样品中α-突触核蛋白聚集体含量

将式(a)50μm的α-突触核蛋白双光子荧光探针与样品中α-突触核蛋白聚集体在常温常压下发生反应，测定荧光寿命，并根据α-突触核蛋白聚集体浓度和荧光寿命的关系，计算样品中α-突触核蛋白聚集体含量。

本发明根据上述方法得到的双光子荧光寿命衰减曲线及其线性范围，可以用于体外检测α-突触核蛋白聚集体浓度的变化。

本发明利用α-突触核蛋白聚集体可以特异性地和α-突触核蛋白双光子荧光探针中dppz配体结合的特点，将α-突触核蛋白双光子荧光探针与不同浓度的α-突触核蛋白聚集体反应，从而得到荧光寿命衰减曲线及其线性范围，进而可以来检测α-突触核蛋白聚集体浓度的变化，其中，所述荧光寿命衰减曲线是根据荧光成像的平均寿命的衰减所作的曲线。

本发明还提供了一种通过荧光寿命成像检测细胞内fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体的方法，具体步骤如下：

(1)将多功能生物纳米复合材料和细胞共培养，使探针进入细胞；

(2)测定荧光寿命，通过荧光寿命成像，根据单细胞中不同区域的寿命变化情况判断fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体的变化及分布情况，从而来测定fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体含量。

其中，步骤(1)中，所述细胞可以是神经瘤母细胞；优选地，所述细胞为培养24h的细胞。

其中，步骤(1)中，所述共培养的温度为25℃-40℃；优选地，为37℃。

其中，步骤(1)中，所述共培养的时间为60min-120min；优选地，为90min。

其中，步骤(1)中，所述共培养的条件为95％o2，5％co2。

其中，步骤(1)中，所述多功能生物纳米复合材料的浓度为30μm-80μm；优选地，为50μm。

其中，步骤(2)中，所述fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体的浓度分别为5～25μm；优选地，为10μm。

本发明中采用800nm双光子激发检测分子荧光寿命，相较于其他方法具有不受光强、浓度、光漂白、细胞自体荧光等影响；定量准确分析；能够实现生物体内检测；组织穿透性强，可用于活体成像等优点。

在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞内通过荧光寿命成像检测细胞内fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体的方法，包括：

(1)制作标准曲线：

①向细胞中加入不同浓度的fe³⁺(0,10,20,30,40,50μm)或者mg-132(0,20,40,60,80,100μm)，共培养24h；

②向已经培养24h的培养皿中加入50μm的多功能生物纳米复合材料，在培养箱中共培养30min，控制培养条件为95％o2，5％co2，37℃；

③用pbs将上述样品清洗3次，再向样品中加入0.5mlpbs溶液，并于leica共聚焦上进行荧光成像(tcssp8)；

④根据各组成像用syphotime-64进行寿命拟合；根据单细胞中不同区域的寿命变化情况判断fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体的变化及分布情况。

(2)测定样品中fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体含量

操作方法同步骤(1)，将样品于leica共聚焦上成像(tcssp8)；并根据寿命拟合曲线或成像的深浅，得出样品中fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体含量。

本发明还提供了一种双光子荧光成像检测鼠脑切片α-突触核蛋白聚集体治疗帕金森病效果的方法，具体步骤如下：

(1)用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导得到帕金森病模型鼠；

(2)将多功能生物纳米复合材料注射到小鼠右侧脑部纹状体，并用近红外激光照射释放药物，切片；

(3)双光子作为激发光进行双光子荧光寿命成像检测，通过测定荧光寿命和α-突触核蛋白聚集体的关系，来分析治疗效果。

其中，步骤(1)中，所述老鼠为8周龄雄性c57bl小鼠6只，平均体重24±2g。

其中，步骤(1)中，所述1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶通过腹膜内注射获得帕金森病模型。

其中，步骤(2)中，所述多功能生物纳米复合材料的浓度为40-60μm；优选地，为50μm。

其中，步骤(2)中，所述近红外激光波长为808nm。

其中，步骤(2)中，所述激光照射时间为5-20min；优选地，为10min。

其中，步骤(2)中，所述双光子作为激发光的波长为690-900nm；优选地，为800nm。

本发明采用800nm双光子激发检测分子荧光寿命，相较于其他方法具有不受光强、浓度、光漂白、细胞自体荧光等影响；定量准确分析；能够实现生物体内检测；组织穿透性强，可用于活体成像等优点。

在本发明的一个具体实施方式中，所述双光子荧光成像检测鼠脑切片α-突触核蛋白聚集体治疗效果的方法，包括：

(1)制作帕金森病模型鼠

给8周龄雄性c57bl小鼠腹膜内注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(30mg/kg)，每天一次连续7天，通过比较5种行为测试，研究了1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶对行为表现，从而获得帕金森病模型鼠。

(2)向鼠脑中注射多功能生物纳米复合材料

在成功构建小鼠帕金森病模型后，用50μm多功能生物纳米复合材料注射鼠脑右侧纹状体，并用808nm激光照射10分钟。

(3)分析帕金森病小鼠脑中α-突触核蛋白聚集体治疗效果

操作方法同步骤(1)，对鼠脑切片样品中的fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体进行荧光寿命成像(tcssp8)，并根据标准曲线或成像深浅，得出鼠脑切片样品中fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体含量。

本发明中，将多功能生物纳米复合材料注射到帕金森模型鼠脑中，通过激光照射释放药物治疗，然后将获得的鼠脑切片在leicatcssp8上进行双光子荧光寿命成像研究。利用双光子荧光寿命光谱对应的颜色和切片颜色进行对照，判断患有帕金森病和治疗后的老鼠鼠脑中fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体含量的差异，进而可以用于探究帕金森病中fe³⁺和α-突触核蛋白的关系，并对α-突触核蛋白毒性聚集状态进行治疗。

本发明的有益效果在于，合成了一种多功能生物纳米复合材料，其由铁离子双光子荧光探针、α-突触核蛋白聚集体双光子荧光探针、多孔中空硫化铜纳米粒子、dna纳米门和α-突触核蛋白聚集体治疗药物复合而成。本发明合成的两个双光子荧光探针，合成步骤短、操作简单，具有高选择性、高荧光量子产率(0.36-0.42)、高双光子吸收截面(593gm-687gm)和高灵敏度(校准曲线的斜率7.7)；硫化铜纳米粒子由一锅法合成，尺寸分布均一(97nm–102nm)、比表面积大(8.7m²g^-1-9.1m²g^-1)，具有良好的载药能力。本发明合成的多功能生物纳米复合材料在体外和体内对铁离子和α-突触核蛋白聚集体的双光子荧光寿命检测和成像，首次解析了帕金森病相关的铁离子和α-突触核蛋白的相互作用关系，并用于细胞及鼠脑切片成像，构建了化疗与光热疗的诊疗一体化平台，对于研究帕金森病的治疗和诊断具有重要意义。

附图说明

图1：多功能纳米材料原理图。

图2：(a)50μm铁离子荧光探针在不同浓度fe³⁺(0-40μm)前后的双光子荧光寿命曲线(插图：探针荧光寿命和fe³⁺浓度的线性关系)；(b)50μmα-突触核蛋白探针在不同浓度α-突触核蛋白聚集体(0-16μm)前后的双光子荧光寿命曲线(插图：探针荧光寿命和α-突触核蛋白聚集体浓度的线性关系)。

图3：50μm多功能纳米粒子培养的神经瘤母细胞在加入不同浓度fe³⁺或mg-132的双光子荧光寿命成像图。

图4：帕金森病模型鼠治疗效果图(a：纳米材料，b：纳米材料+光照，c：纳米材料+药物，d：纳米材料+药物+光照)。

图5：50μm两个荧光探针对生物体内含有的常见金属离子和蛋白质的选择性实验图；其中，a为金属离子，b为蛋白质。

图6：shsy-5y细胞毒性实验结果。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：铁离子双光子荧光探针的合成

将1mmol四丁基硫酸氢铵，22mmol4-二乙基氨基苯甲醛和10mmol2-氨基-4,6-二甲基嘧啶在50ml5mnaoh溶液中回流2小时。通过旋蒸得到橙色产物，并通过柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)得到纯物质。

实施例2：α-突触核蛋白双光子荧光探针的合成

将56mmol三氯化钌，112mmol邻二氮菲和3.7mmol氯化锂在25mldmf中回流8小时。然后将丙酮加入到反应混合物中，将其在4℃下冷却过夜，产物ru(phen)2cl2无需进一步纯化即可使用。12mmolru(phen)2cl2和10mmol二吡啶并[3,2-a:2'.3'-c]吩嗪在1：1的甲醇水溶液中回流4小时。将装置冷却到室温，加入六氟磷酸铵使产物从溶液中沉淀出来并过滤得到粗产物。通过柱色谱(二氯甲烷：乙腈＝4：1)和重结晶(乙醇：水＝90:10)纯化得到红橙色晶体。

实施例3：多功能生物纳米复合材料的合成

在ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，5ml10μg/ml的硫化铜纳米球中加入20μg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐搅拌2小时，然后加入20μgn-羟基琥珀酰亚胺搅拌半小时，之后，在搅拌下将100μl50μg/ml本发明实施例1制备的铁离子双光子荧光探针加入混合物中过夜。通过离心收集产物并通过用去离子水洗涤次数来纯化，然后重悬于5mlph＝7.4的pbs缓冲溶液中。最后，将100μl50μg/ml本发明实施例2制备的α-突触核蛋白双光子荧光探针加入到溶液中并在室温下搅拌过夜。通过离心收集所得产物，并通过用去离子水洗涤次数来纯化，然后重悬于5mlph＝7.4的pbs缓冲溶液中。最后，将药物雷帕霉素装载到硫化铜纳米球里并以dna纳米门封孔，从而构建了一个多功能生物纳米复合材料。

实施例4：铁离子双光子荧光探针体外检测fe³⁺

将式(a)所示的50μm的本发明实施例1制备的铁离子双光子荧光探针与含有不同浓度的fe³⁺(0,2,4,6,8,10,20,30,40μm)的细胞裂解液常温常压下发生反应，记录不同浓度下的荧光寿命衰减曲线，然后做出各组荧光寿命和fe³⁺浓度的关系曲线，得出线性范围为0-10μm。得到荧光寿命衰减曲线和其线性关系(图2)。图2为本发明实施例1制备的铁离子双光子荧光探针在不同浓度fe³⁺(0,2,4,6,8,10,20,30,40μm)条件下的荧光寿命曲线，由图2可知，荧光寿命变化范围为1.46ns～1.375ns，表明该探针可很好的用于荧光寿命成像分析。

实施例5：α-突触核蛋白双光子荧光探针体外检测α-突触核蛋白

将式(b)所示的50μm的本发明实施例2制备的α-突触核蛋白双光子荧光探针与含有不同浓度的α-突触核蛋白聚集体(0,2,4,6,8,10,12,14,16μm)的细胞裂解液常温常压下发生反应，记录不同浓度下的荧光寿命衰减曲线，然后做出各组荧光寿命和α-突触核蛋白聚集体浓度的关系曲线，得出线性范围为0-10μm。得到荧光寿命衰减曲线和其线性关系(图2)。图2为本发明实施例2制备的α-突触核蛋白双光子荧光探针在不同浓度fe³⁺(0,2,4,6,8,10,12,14，16μm)条件下的荧光寿命曲线，由图2可知，荧光寿命变化范围为136.4ns～198.3ns，表明该探针可很好的用于荧光寿命成像分析。

实施例6：多功能生物纳米复合材料用于神经瘤母细胞(shsy-5y)的双光子荧光寿命成像

将上述含有不同浓度的fe³⁺或者mg-132的神经瘤母细胞进行荧光寿命成像实验，实验分为对照组、实验组b～f共五组，对照组不加fe³⁺，向实验组b～f中分别加入不同浓度的fe³⁺(10，20，30，40，50μm)或者mg-132(10，20，30，40，50μm)。向已经共同培养24h的培养皿中加入50μm的多功能纳米材料，在培养箱中共培养30min，控制培养条件为95％o2，5％co2，37℃。用pbs将上述样品清洗3次，并于leica共聚焦上进行荧光寿命成像(tcssp8)，最后根据各组成像用syphotime-64进行寿命拟合。实验结果如图3所示，第一行，细胞共孵育不同浓度的铁离子(0，10，20，30，40，50μm)24小时后加入50μm复合纳米材料，由荧光寿命成像图观察到铁离子双光子荧光探针的寿命逐渐减少，随后α-突触核蛋白双光子荧光探针的寿命逐渐增加。这说明了铁离子浓度增加会促进α-突触核蛋白的聚集。第二行，细胞共孵育不同浓度的mg-132(0，10，20，30，40，50μm)24小时后加入50μm复合纳米材料，由荧光寿命成像图观察到α-突触核蛋白双光子荧光探针的寿命逐渐增加，随后铁离子双光子荧光探针的寿命逐渐减少。这说明了α-突触核蛋白的聚集也会反过来促进铁离子浓度增加。由图3可知，多功能生物纳米复合材料可以很好的用于细胞的荧光寿命成像。

通过测定荧光寿命成像，通过单细胞中不同区域的荧光寿命变化情况，本发明可以用于单细胞中不同区域fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体变化的研究。

实施例7：多功能生物纳米复合材料用于帕金森病鼠脑切片的双光子荧光成像

利用双光子光谱对应的颜色和切片颜色进行对照，判断帕金森病鼠脑和经过药物治疗鼠脑中fe³⁺和α-突触核蛋白聚集体含量的差异，进而分析帕金森病鼠脑中α-突触核蛋白聚集体治疗效果。

将50μm本发明多功能生物纳米复合材料注射到帕金森模型鼠脑中，通过808nm激光照射释放药物治疗10min，然后将获得的鼠脑切片用800nm的双光子作为激发光，在leicatcssp8上进行双光子成像检测。

实验结果如图4所示，第一行为治疗效果荧光寿命成像图，由图可知，单独的纳米材料(a列)和纳米材料+808nm激光照射(b列)对鼠脑内铁离子和α-突触核蛋白聚集体浓度几乎没有影响；当纳米材料装载了药物雷帕霉素后(c列)进入鼠脑，铁离子双光子荧光探针荧光寿命略微增加，α-突触核蛋白双光子荧光寿命略微减少，证明其对治疗具有一定效果；在此基础上，利用808nm激光照射(d列)打开dna纳米门，大量释放药物雷帕霉素治疗纤维状α-突触核蛋白，随之铁离子浓度大幅度降低，证明了该纳米复合材料对帕金森模型小鼠具有良好的治疗效果。

图4的酪氨酸羟化酶活性(第二行)，单独的纳米材料(a列)和纳米材料+808nm激光照射(b列)对酪氨酸羟化酶活性影响不大；当纳米材料装载药物雷帕霉素后，其对酪氨酸羟化酶活性有一定的促进作用；在此基础上，利用808nm激光照射(d列)打开dna纳米门，大量释放药物雷帕霉素治疗，使得酪氨酸羟化酶活性大幅度提高。

图4的α-突触核蛋白活性(第三行)，单独的纳米材料(a列)和纳米材料+808nm激光照射(b列)对α-突触核蛋白活性影响不大；当纳米材料装载药物雷帕霉素后，其对α-突触核蛋白活性有一定的促进作用；在此基础上，利用808nm激光照射(d列)打开dna纳米门，大量释放药物雷帕霉素治疗，使得α-突触核蛋白活性大幅度提高，证明其对纤维状α-突触核蛋白治疗效果。

图4的he染色(第四行)和tunel染色(第五行)，单独的纳米材料(a列)和纳米材料+808nm激光照射(b列)处理时细胞凋亡都比较多；当纳米材料装载药物雷帕霉素后，细胞凋亡有所减少；在此基础上，利用808nm激光照射(d列)打开dna纳米门，大量释放药物雷帕霉素治疗，使得细胞活性大幅度提高，结果均证实本发明纳米复合材料对帕金森模型小鼠具有良好的治疗效果。

实施例8：选择性试验

将实施例1和2制备的铁离子和α-突触核蛋白双光子荧光探针与生物体内含有的常见金属离子、蛋白质等进行反应，进行选择性实验。

将50μm本发明实施例1制备的铁离子双光子荧光探针与金属离子(1.0mm的k⁺,na⁺,ca²⁺,mg²⁺；25mforfe³⁺,pb²⁺,fe²⁺,cu²⁺,al³⁺andcu⁺)(图5)反应后，得到对应的荧光寿命值，根据各组曲线绘制(l0-l)/l0图。将50μm的α-突触核蛋白探针与蛋白(50μm的tau,gfap,sph1,th,erk2,map-1b,ub,grk5,vmat2,α-tub)反应后，得到对应的荧光寿命值，根据各组曲线绘制(l0-l)/l0图。

50μm本发明实施例1制备的铁离子双光子荧光探针在ph为4.0-9.0的范围内，测得荧光寿命值，绘制不同ph和荧光寿命关系图。

50μm本发明实施例1制备的铁离子双光子荧光探针在温度在0-50oc的范围内，测得荧光寿命值，绘制不同温度和荧光寿命关系图。

实验结果：两个荧光探针具有很好的选择性和ph和温度稳定性，可以很好的用于活体成像实验。

实施例9：细胞毒性试验

利用mtt实验来进行本发明实施例3制备的多功能生物纳米复合材料的细胞毒性实验。将96孔板中的shsy-5y细胞分为8组，分别为阴性组、阳性组、空白对照和实验组(共8组)，其中，实验组为本发明实施例3制备的多功能生物纳米复合材料，浓度分别为30，60，90，120μg/ml。8组分别共培养24h和48h后，加入20μlmtt试剂，反应4h后，去除96孔中的上清液，加入80μl的dmso进行显色反应，最后进行紫外测定。

其中，所述阴性对照组加入了曲拉通，细胞全致死组。

其中，所述阳性对照组未加本发明实施例3制备的多功能生物纳米复合材料。

其中，所述空白对照为未加细胞及本发明实施例3制备的多功能生物纳米复合材料。

实验结果如图6所示，由图6可知，细胞活性在多功能生物纳米复合材料浓度分别为30，60，90，120μg/ml的条件下都大于90％，表明本发明实施例3制备的多功能生物纳米复合材料具有很低的细胞毒性，可以很好的用于活体成像实验。

实施例10：t检验法

t检验是用t分布理论来推论差异发生的概率，从而比较两个平均数的差异是否显著。本发明利用t检验法来证明本发明制备的荧光探针检测的准确度。对于铁离子双光子荧光探针，本发明选用商业探针罗丹明酰肼作为对比。当铁离子浓度分别为20μm和40μm时，分别测得两个探针的荧光强度，进行三组平行实验，算出其方差值，最终算出t值与标准值对比。对于α-突触核蛋白双光子荧光探针，本发明选用商业探针硫磺素t作为对比。当α-突触核蛋白原纤维浓度分别为2μm和6μm时，分别测得两个探针的荧光强度，进行三组平行实验，算出其方差值，最终算出t值与标准值对比。

实验结果如表格1所示，由表1可知，根据测试的统计计算(α＝0.05)，本发明合成的铁离子双光子荧光探针的浓度与商业探针罗丹明酰肼检测的浓度一致。具体地，本发明铁离子浓度为20μm时，t＝0.32；铁离子浓度为40μm时，t＝0.47，这个值远小于标准值2.78，表明本方法的测定结果与罗丹明酰肼的测定结果一致。此外，本发明还将合成的α-突触核蛋白双光子荧光探针与商业化的硫磺素t检测结果进行比对。具体地，本发明α-突触核蛋白原纤维浓度为6μm时，t＝1.09；α-突触核蛋白原纤维浓度为10μm时，t＝1.08，这个值远小于标准值2.78，表明本方法的测定结果与硫磺素t的测定结果一致。

表1t检验法实验结果

t检验法

α＝0.05，f＝4

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

sequencelisting

<110>华东师范大学

<120>一种生物纳米复合材料及其合成方法和应用

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<170>patentinversion3.3

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