基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途与流程

本发明属于有机功能材料，涉及检测微量物质的荧光探针分子、制备方法及用途。

背景技术：

过氧化氢是活性氧族的一员，与生物体的生命过程密切相关。报道显示，细胞内内源性的过氧化氢主要产生于细胞内的有氧呼吸中通过线粒体电子传递链过程，它不仅在细胞内的氧化应激反应中扮演着细胞毒物的角色，而且还是重要的信使分子。同时，研究发现，过氧化氢参与包括伤口愈合、免疫和干细胞增殖等病理和生理过程，而细胞内异常的过氧化氢代谢水平与许多疾病密切相关，如炎症，衰老，癌症，糖尿病和神经退行性疾病。

常见的过氧化氢荧光探针测试法中使用的荧光团，大多基于硼酸酯为识别基团，其发射波长大多位于蓝光和绿光区域，该波长无法穿透生物组织进行成像，反而易干扰荧光背景，而且，过氧亚硝基，羟基自由基等活性氧自由基干扰该类探针特定性识别，极大限制了探针应用。因此，制备近红外、灵敏性高、响应速度快、选择性高的过氧化氢探针具有重要的理论及应用价值。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种近红外、灵敏性高、选择性优良的基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途。

本发明通过以下技术方案实现上述目的，包括：

(一)基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子

具有如下结构：

(二)制备基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子的方法

包括以下步骤：

(1)将1-(2-羟基苯基)乙酮和钠在乙酸乙酯中室温剧烈搅拌4小时，得到的灰绿色固体经过滤，溶解在去离子水中，调节溶液的ph至中性，用乙酸乙酯萃取三次该水溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到固体物，为化合物5；

(2)用乙酸溶解步骤(1)所述化合物5，缓慢加入硫酸，加热回流30分钟，倒入冰水中，用碳酸钠调节溶液的ph至中性，用二氯甲烷萃取三次水溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到固体物，为化合物4；

(3)用乙酸酐溶解步骤(2)所述化合物4和丙二腈，加热回流14小时，减压蒸馏，加入去离子水，继续加热回流0.5小时，用二氯甲烷萃取三次水溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用洗脱剂分离提纯，得到化合物3；

(4)将步骤(3)所述化合物3和对乙酰氨基苯甲醛溶解到甲苯中，加入冰乙酸和哌啶，在氮气保护下加热回流36小时，反应液冷却至室温，得到的橙色固体经过滤后，于浓盐酸和乙醇的混合溶液加热回流24小时，在冰浴条件下用饱和naoh调节ph至中性，用乙酸乙酯萃取三次，用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用第二洗脱剂分离提纯，得到的固体物，为化合物2；

(5)用无水二氯甲烷溶解对硝基苯乙酮酸、n,n-二异丙基乙胺和2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐，在氮气保护下冰浴反应1.5小时，加入步骤(4)所述化合物2，继续冰浴反应5小时，撤去冰浴，室温下反应12h，点板确认反应结束后，用去离子水洗三次反应溶液，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，得到固体混合物，经硅胶层析柱用洗脱剂分离提纯，得到的固体物即为基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子。

优选地，所述步骤(1)中1-((2-羟基苯基)乙酮和钠的比例为10g:8g。

优选地，所述步骤(2)中化合物5、冰醋酸及硫酸的质量比为6.95g:73.5g:8.46g。

优选地，所述步骤(3)中化合物4与丙二腈的摩尔比为1:1.2，所述洗脱剂为石油醚与二氯甲烷的混合物，其体积比为3:7。

优选地，所述步骤(4)中化合物3与对乙酰氨基苯甲醛的摩尔比为1:1，浓盐酸与乙醇的混合溶液体积比为3:2，所述洗脱剂为二氯甲烷。

优选地，所述步骤(5)中对硝基苯乙酮酸、n,n-二异丙基乙胺和2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐及化合物2的摩尔比为10:2:2:1；所述洗脱剂为石油醚与二氯甲烷的混合物，其体积比为1.5:1。

(三)基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子的用途

优选地，所述用途是检测水体样品、细胞内、线虫体内、斑马鱼体内的过氧化氢。

本发明中，我们提供了基于苯并吡喃腈荧光探针分子的制备方法及应用，该荧光探针分子由一种结构清晰、光性质稳定的荧光团以及能够提供与特定的活性氧自由基——过氧化氢发生亲核反应的偶羰基组成。当偶羰基的酰胺键断开，改变了荧光探针分子的颜色及荧光，从而选择性地识别和检测液相体系中的过氧化氢。其显著进步在于：

1、本发明荧光探针分子合成方法为五个步骤，易合成，收率高。

2、本发明荧光探针分子含有可与过氧化氢发生亲核作用的偶羰基团，对过氧化氢有很好的选择性，对其它活性氧、活性氮、活性硫等物质具有抗干扰性(见图7)。

3、本发明荧光探针分子激发和发射光谱在近红外可见区，其荧光探针分子穿透细胞的渗透能力好，且物理化学性质稳定性良好。

4、本发明荧光探针分子与过氧化氢反应前后，其荧光发射在水溶液、细胞、线虫体、斑马鱼内增长约22倍，检测整个识别过程颜色及荧光变化灵敏度高，能够检测水溶液中的过氧化氢以及荧光成像细胞、线虫和斑马鱼体内的过氧化氢。

5、本发明对细胞本身毒副作用小，可以实现线虫及斑马鱼体内过氧化氢的荧光检测。

基于以上优势，该荧光探针分子可应用于荧光识别和检测环境水体样品、活体动物中的过氧化氢，具有潜在的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的合成路线。

图2为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的¹h-nmr谱图。

图3为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的¹³c-nmr谱图。

图4为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的hrms(esi)谱图。

图5为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中对过氧化氢响应的紫外变化光谱图。

图6为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中对过氧化氢响应荧光光谱变化图。

图7为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中对不同金属离子在653nm处荧光强度柱状图；

图8为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中对不同浓度过氧化氢紫外光谱变化图。

图9为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中对不同浓度过氧化氢荧光光谱变化图。

图10为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在653nm处荧光强度与相对应h2o2离子浓度拟合曲线图。

图11为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的细胞毒性试验图。

图12为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在细胞内对外源性过氧化氢荧光识别图。其中，a,e,i为明场；b,f,j为dapi通道；c为只加入20μmol/l的探针化合物的荧光图片；g为先加入220μmol/lh2o2哺育3h再加入20μmol/l的探针化合物再哺育2h的荧光图片；k为先加入440μmol/lh2o2哺育3h再加入20μmol/l的探针化合物再哺育2h的荧光图片；d,h,l为叠加通道。

图13为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在细胞内对内源性过氧化氢荧光识别图。其中，a-d为dapi通道；e为只加入20μmol/l的探针化合物的荧光图片；f为先加入40μmol/l丙二醇甲醚醋酸酯(pma)哺育0.5h再加入20μmol/l的探针化合物再哺育1h的荧光图片；g为先加入4μmol/l鱼藤酮(rotenone)哺育0.5h再加入20μmol/l的探针化合物再哺育1h的荧光图片；h为先加入400μmol/l百草枯(pq)哺育0.5h再加入20μmol/l的探针化合物再哺育2h的荧光图片。

图14为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在线虫体内对过氧化氢荧光识别图。其中，a-c为明场；d为只加入20μmol/l的探针化合物的荧光图片；e为先加入220μmol/lh2o2哺育2h再加入20μmol/l的探针化合物再哺育1h的荧光图片；f为先加入440μmol/lh2o2哺育2h再加入20μmol/l的探针化合物再哺育1h的荧光图片。

图15为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在斑马鱼体内对过氧化氢荧光识别图。其中，a,c为只加入20μmol/l的探针化合物的荧光图片；b,d为先加入20μmol/lcuso4哺育1h再加入20μmol/l的探针化合物再哺育1h的荧光图片。

具体实施方式

实施例1：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的合成

具体合成路线见图1。

(1)化合物5的制备：取1-(2-羟基苯基)乙酮(10.0g，73.5mmol)，钠(8.00g，0.34mmol)溶解到200ml乙酸乙酯中，室温剧烈搅拌4小时。反应结束后，将得到的灰绿色固体过滤后，溶解在去离子水中，用饱和naoh调节溶液的ph至中性。得到的水溶液用乙酸乙酯萃取三次，有机相再用无水硫酸钠干燥并过滤，然后减压蒸馏得到固体物质为化合物5为棕色固体，所得粗产物无需进一步纯化直接用于下一步，产率为53％。

(2)化合物4的制备：将4.6ml硫酸缓慢加入到含有化合物5(6.95g，38.9mmol)的70ml醋酸中，反应混合物加热回流约30分钟，然后倒入800ml冰水中，用碳酸钠将溶液的ph调节至中性。所得水溶液用二氯甲烷萃取三次，有机相再用无水硫酸钠干燥并过滤，然后减压蒸馏得到最终的粗产物，化合物4为针状灰色固体，将粗产物直接用于下一反应无需进一步纯化，产率76.9％。

(3)化合物3的制备：将化合物4(4.78g，29.9mmol)和丙二腈(2.40g，36.2mmol)溶解到25ml乙酸酐中，加热回流14小时，然后减压蒸馏，加入80ml去离子水，继续加热回流0.5小时，得到的水溶液用二氯甲烷萃取三次，有机相再用无水硫酸钠干燥并过滤，然后减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱，用石油醚:：二氯甲烷＝3:7洗脱，浓缩洗脱液得2.02g橙色化合物，其产率为32.5％。1hnmr(400mhz,cdcl3),δ8.92(d,1h),7.72(t,1h),7.46(d,1h),7.45(t,2h),6.72(s,1h),2.44(s,3h)。

(4)化合物2的制备：将化合物3(2.08g，1mmol)和对乙酰氨基苯甲醛(1.63g，1mmol)溶解到60ml甲苯中，加入两滴冰乙酸和哌啶，在氮气的保护下加热回流36小时，将反应液冷却至室温，得到的橙色固体经过滤后，在浓盐酸：乙醇＝3:2(v:v)的混合溶液加热回流24小时。冷却后在冰浴条件下用饱和naoh调节ph为7左右，然后用乙酸乙酯萃取三次，得到的有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱，用二氯甲烷洗脱，浓缩洗脱液得76mg暗红色化合物，产率24.7％。1hnmr(400mhz,dmso),δ8.73(d,1h),7.89(t,1h),7.77(d,1h),7.64(d,1h),7.58(t,1h,j＝8.0hz),7.49(d,1h),7.08(d,1h),6.87(s,1h),6.61(d,2h),5.99(s,2h)。

(5)苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子1的合成：将对硝基苯乙酮酸(195mg，1mmol)、n,n-二异丙基乙胺(160ml，0.2mmol)和2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐(228mg，0.2mmol)溶解到50ml无水二氯甲烷中，在氮气的保护下，冰浴反应1.5小时，加入化合物2(31.1mg，0.1mmol)，继续冰浴反应5小时后，撤去冰浴，室温下反应12h。点板确认反应结束后，得到的反应溶液用去离子水洗三次，再用无水硫酸钠干燥并过滤，然后减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱，用石油醚：二氯甲烷＝1.5:1洗脱，浓缩洗脱液得41.5mg橘红色化合物，产率85.2％。¹h-nmr(600mhz,d6-dmso):δ7.015(s,1h),7.460(d,1h),7.616(t,1h),7.735(d,1h),7.805(t,3h),7.917(m,3h),8.333(d,2h),8.405(d,2h),8.728(d,1h),11.230(s,1h).¹³c-nmr(600mhz,d6-dmso):δ60.69,107.11,116.31,117.58,117.63,119.37,119.54,120.99,124.32,125.14,126.65,129.58,131.82,132.13,135.91,138.05,138.50,139.84,151.02,152.52,153.38,158.66,162.03,,187.69.hrms(esi):calcdforc28h16n4o5[m-h]^-＝487.1121,foundm/z487.1045.其中，dmso-d6为氘代二甲基亚砜。相关谱图见图2～4。

实施例2：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢紫外检测的选择性

采用dmso(二甲基亚砜)：pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)＝7:3(v:v)溶液控制实验条件。

将基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子用dmso:pbs＝7:3(v:v)的溶剂溶解并定容到100ml的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/l的溶液。

将样品瓶分为14组，每组各样品瓶分别加入5ml浓度为20μmol/l的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的dmso:pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)＝7:3(v:v)溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它13组分别加入22μl浓度为0.01mol/l的clo^-,h2o2,·oh,tbhp,o2¹,o2^·-,·no,gsh,hcy,cys,s^2-,onoo^-,roo·的水溶液。在37℃下静置15分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其紫外光谱。

基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢的紫外选择性检测如图5所示。结果表明基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子仅对过氧化氢在487nm处出现明显的紫外吸收峰。该结果表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢表现出高度的紫外选择性。

实施例3：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢荧光检测的选择性

采用dmso(二甲基亚砜)：pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)＝7:3(v:v)溶液控制实验条件。

将基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子用dmso:pbs＝7:3(v:v)的溶剂溶解并定容到100ml的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/l的溶液。

将样品瓶分为14组，每组各样品瓶分别加入5ml浓度为20μmol/l的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的dmso:pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)＝7:3(v:v)溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它13组分别加入22μl浓度为0.01mol/l的clo^-,h2o2,·oh,tbhp,o2¹,o2^·-,·no,gsh,hcy,cys,s^2-,onoo^-,roo·的水溶液。在37℃下静置15分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。激发波长为487nm，发射波长为653nm。基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢荧光选择性检测如图6所示。可见基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在653nm处仅对h2o2有明显的荧光增强现象(约22倍增强)，表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢表现出高度的荧光选择性。

我们选用了在653nm处各个离子的荧光强度值做了一个柱形图(图7)，图7可以直观地看出探针的荧光选择性非常好。

实施例4：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢的定量紫外检测

采用dmso(二甲基亚砜)：pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)＝7:3(v:v)溶液控制实验条件。

将基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子用dmso:pbs＝7:3(v:v)的溶剂溶解并定容到100ml的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/l的溶液。

准确移取50.2μl30％过氧化氢溶液，用50ml去离子水溶解，配制成成浓度为0.01mol/l的h2o2水溶液。

将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5ml浓度为20μmol/l的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的dmso:pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)＝7:3(v:v)溶液，再分别加入0μl～22μl浓度为0.01mol/l的h2o2水溶液，使测试体系中过氧化氢浓度为0μmol/l～440μmol/l。在37℃下静置15分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其紫外光谱。

图8为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中随过氧化氢浓度变化的紫外光谱图，表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测过氧化氢浓度。

实施例5：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢的定量荧光检测

采用dmso(二甲基亚砜)：pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)＝7:3(v:v)溶液控制实验条件。

将基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子用dmso:pbs＝7:3(v:v)的溶剂溶解并定容到100ml的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/l的溶液。

准确移取50.2μl30％过氧化氢溶液，用50ml去离子水溶解，配制成成浓度为0.01mol/l的h2o2水溶液。

将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5ml浓度为20μmol/l的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的dmso:pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)＝7:3(v:v)溶液，再分别加入0μl～22μl浓度为0.01mol/l的h2o2水溶液，使测试体系中过氧化氢浓度为0μmol/l～440μmol/l。在37℃下静置15分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。荧光测试光栅缝隙大小为5×5nm。图9为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中随过氧化氢浓度变化的荧光光谱图。将荧光光谱653nm处的荧光强度与相应过氧化氢浓度进行拟合，在过氧化氢浓度为0μmol/l～440μmol/l范围内得到一拟合曲线(图10)，表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测过氧化氢浓度。

实施例6：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在细胞内对外源性过氧化氢的荧光识别

取三培养皿hi-5细胞，将培养皿中的hi-5细胞用pbs缓冲液(每升缓冲液中含有2.90克na2hpo4·12h2o；0.30克nah2po4·2h2o)清洗三次，以除去培养液。再向这三培养皿hi-5细胞中加入1mlpbs溶液，然后分别向hi-5细胞中分别加入浓度为0.01mol/l的过氧化氢溶液0μl、22μl、44μl，并将皿放于无菌培养箱中在37℃下孵育1小时。hi-5细胞用pbs缓冲液洗涤3次，之后向培养皿中加入浓度为2mmol/l的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子10μl，并将皿放于无菌培养箱中37℃孵育1小时。hi-5细胞再次用pbs溶液洗涤3次后，加入10μl2mmol/l细胞核染色剂dapi后继续孵育半小时，然后放置在荧光共聚焦显微镜下进行荧光成像实验。结果见图12。图12c中可以看到基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子自身在细胞质内基本无荧光发射，当过氧化氢浓度达到440μmol/l时，细胞内发射出红色荧光(图12k)。该实验表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子可以在细胞内对外源性的过氧化氢进行荧光识别。实验所用仪器为olympusfv-10i激光共聚焦显微镜。

实施例7：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在细胞内对内源性过氧化氢的荧光识别

取四培养皿hi-5细胞，将培养皿中的hi-5细胞用pbs缓冲液(每升缓冲液中含有2.90克na2hpo4·12h2o；0.30克nah2po4·2h2o)清洗三次，以除去培养液。再向这三培养皿hi-5细胞中加入1mlpbs溶液，然后分别向其中三皿hi-5细胞中分别加入浓度为40μmol/l丙二醇甲醚醋酸酯(pma)，4μmol/l鱼藤酮(rotenone)，400μmol/l的百草枯(pq)，并将培养皿放于无菌培养箱中在37℃下孵育0.5小时。hi-5细胞用pbs缓冲液洗涤3次，之后向培养皿中加入浓度为2mmol/l的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子10μl，并将皿放于无菌培养箱中37℃孵育1小时。hi-5细胞再次用pbs溶液洗涤3次后，加入10μl2mmol/l细胞核染色剂dapi后继续孵育半小时，然后放置在荧光共聚焦显微镜下进行荧光成像实验。结果见图13。图13e中可以看到基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子自身在细胞质内基本无荧光发射，当用上述刺激物孵育后，细胞内发射出红色荧光(图13f,g,h)。该实验表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子可以在细胞内对内源性的过氧化氢进行荧光识别。实验所用仪器为olympusfv-10i激光共聚焦显微镜。

实施例8：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在线虫体内对过氧化氢的荧光识别

将培养皿中的线虫用m9缓冲液(每升缓冲液中含有15.12克na2hpo4·12h2o；3克kh2po4；5克nacl；0.25克mgso4·7h2o)洗出来，分三组装到离心管中。再向这三组离心管中加入1mlm9溶液，然后分别向这三组离心管中分别加入浓度为0.01mol/l的过氧化氢溶液0μl、2.2μl、4.4μl，在室温条件下孵育2小时。线虫用m9缓冲液洗涤3次，在3000r/min速度下离心3分钟，之后向装有线虫的离心管内加入浓度为2mmol/l的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子10μl，并在20℃孵育1小时。线虫再次用m9溶液洗涤3次，在3000r/min速度下离心3分钟后转移到载玻片上进行荧光成像实验。结果见图14。图14d中可以看到基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子自身在线虫内基本无荧光发射；当过氧化氢浓度达到440μmol/l时，线虫体内发射出红色荧光(图14f)。该实验表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子可以在线虫体内对过氧化氢进行荧光识别。实验所用

实施例9：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在斑马鱼体内对过氧化氢的荧光识别

将培养皿中的刚孵化三天的ab型斑马鱼胚胎用e3缓冲液(每升缓冲液中含有0.29克nac；0.013克kcl；0.048克cacl2·2h2o；0.082克mgso4·7h2o)，分两组装到离心管中，每组1ml。然后分别向这两组离心管中分别加入浓度为0μmol/l，20μmol/l的硫酸铜溶液，在室温条件下孵育1h。斑马鱼胚胎用e3缓冲液洗涤3次，之后向装有斑马鱼胚胎的离心管内加入浓度为2mmol/l的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子10μl，并在20℃孵1小时。斑马鱼胚胎再次用e3溶液洗涤3次后转移到凹槽载玻片上进行荧光成像实验。结果见图15。图15a,c中可以看到基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子自身在斑马鱼胚胎体内基本无荧光发射；当用20μmol/l的硫酸铜溶液刺激斑马鱼胚胎发生炎症时，斑马鱼胚胎体内发射出红色荧光(图15b,d)。该实验表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子可以在斑马鱼胚胎体内对内源性的过氧化氢进行荧光识别。实验所用仪器为olympusix71荧光显微镜。