本发明生物材料技术领域，具体涉及一类近红外第二窗口激发/发射的荧光染料及其制备方法。
背景技术：
目前常见的分子影像技术如断层扫描成像(CT)，超声成像(US)和磁共振成像(MRI)被用于临床医疗诊断。但是，这些成像技术具有相应的缺点，如空间分辨率较差，无法实时监控，造影剂无法官能团化等。荧光成像具有实时、非侵入性、所需样品量少、高分辨率等优点，在生命科学、临床医疗诊断和荧光免疫分析检测等领域已经被广泛使用。目前，研究者们正聚焦在近红外第二窗口(1000nm～1700nm)内的生物荧光成像和检测，这是因为相对于可见-近红外第一窗口(400～900nm)，生物组织在此波段内自身的吸收和散射较弱，会极大的提高成像质量和穿透深度。
所以，开发激发波长和发射波长都位于近红外第二窗口的荧光染料是目前的研究重点。目前，无机材料如稀土纳米颗粒，量子点，碳纳米管能够实现近红外第二窗口区的发射，但是它们的发射波长都位于近红外第一窗口内，同时含有重金属元素具有潜在的生物毒性，进入活体后代谢缓慢，且在水中溶解性差，这大大限制了它们的生物应用价值。相对于无机材料，有机荧光染料因其相对分子量较小，易于代谢，更易于临床转化等优势，已经引起了研究者们的广泛关注。菁类荧光染料作为荧光染料中的一员在生物标记(DNA和蛋白质的标记)、活细胞以及活体组织成像应用方面有其突出的优点，如摩尔消光系数大、最大吸收和发射波长可以随着共轭链的延长而增加。目前临床批准的菁类染料只有吲哚菁绿(ICG),但其分子的最大吸收和发射波长均位于近红外第一窗口内，同时分子无法进行生物标记。同时，多甲川菁染料一般都是对称的结构，缺少单一的荧光标记反应的活性位点。在荧光生物标记时，荧光染料最好在分子中含有一个单一的可活化的基团(如氨基、羧基等)，用于特定的衍生反应得到理想的荧光探针分子。而为了得到这样含有单一活性基团的多甲川菁染料，一般是合成出不对称的菁类染料，在分子的一端引入一个活性基团。但这种方法使得染料的合成和分离提纯变得复杂和困难。因此，本发明开发了最大吸收和发射波长均位于近红外第二窗口的菁类染料，同时在其对称结构中引入反应活性位点，易于后期的生物标记。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前菁类染料吸收和发射波长较短，不易生物标记的问题，提供一类制备工艺简单、生物相容性好，光稳定性高，易于后期生物标记的近红外第二窗口激发和发射的荧光染料及其制备方法和应用。
本发明所提供的易于生物标记的近红外第二窗口激发和发射的荧光染料，为有机小分子七甲川菁染料荧光染料，记为FD染料，在其对称结构中引入了反应活性位点，易于后期的生物标记。其化合结构通式如下：
其中：
R1和R2各自独立选自(CH2)nR8、(CH2)mOR9、(CHR10CH2O)pR9或CH2C6H4R8；
R3、R4和R8各自独立选自为H、Cl、SO3R11或COOR12；
R5为OR15、SR16或NHR17；
R9为H或C1-18烷基；
R10为H或CH3；
R11为H或M；M＝Na、K、N(R13、R14)；
R12为H、M、R6、R7、NH(CH2)yR18或C1-18烷基；
R13、R14为H、C1-18烷基、(CH2)mOR9或(CHR10CH2O)pR9；
R15、R16、R17为R1、C6H4(CH2)sCOR19或(CH2)tCOR19；
R18为H、R6、R7、N3；
R19为OR12；
Y-为卤素负离子或者OTs-；
n、m、p、s、t、y为0-18的整数。
本发明中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基；术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘；OTs-指对甲苯磺酸根离子。
本发明的化合物的母体结构上取代基的作用是调节染料在有机溶剂或者水溶液中的溶解性。其中优选R1和R2各自独立选自(CH2)nR10。
本发明化合物中，优选R3和R4各自独立选自H或Cl。
本发明化合物中，优选R5选自OR15、SR16或NHR17。
本发明化合物中，最优选为，R1和R2选自CH3、(CH2)3SO3，R3和R4选自H，R5为OC6H4CH2COOH或OC6H4CH2COOR6；即为下述化合物FD-1、FD-2、FD-3和FD-4：
本发明还提供上述近红外第二窗口激发和发射的荧光染料的制备方法，具体步骤如下：
(1)连有取代基R3或R4的萘内酰亚胺与磺酸内酯或R1或R2CH2Z反应制得化合物Ⅰ，其反应式为下式所示：
其中，或者OTs，反应温度为80～140℃，反应时间为4～18小时，反应溶剂选自N-甲基-2-吡咯烷酮、甲苯或N,N-二甲基甲酰胺，碱性化合物为氢化钠、氢化钾、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铯；吲哚化合物、磺酸内酯或R1或R2CH2Z与碱性化合物的投料摩尔比为1:1.1:2～1:1.5:3(即1:(1.1～1.5):(2～3))。
(2)化合物Ⅰ与格氏试剂MeMgZ反应生成化合物Ⅱ，其反应式为下式所示：
其中，Z是卤素，反应温度为0～80℃，反应时间为0.1～5小时，反应溶剂选自四氢呋喃、乙腈或乙醇；化合物Ⅰ与格氏试剂的投料摩尔比为1:3～1:5(即1:(3～5))。
(3)化合物Ⅱ与缩合剂Ⅲ反应生成化合物FD染料，其反应式为下式所示：
其中，反应溶剂为乙酸酐，催化剂为乙酸钠，反应温度为20～140℃，反应时间为1～5小时；化合物Ⅱ和乙酸钠与缩合剂Ⅲ的投料摩尔比1:0.9:0.45～1:1.2:0.55(即1:(0.9～1.2):(0.45～0.55))。
(4)合物FD与HOR13、HSR14或NH2R15反应生成化合物FD-O、FD-S或FD-N，其反应式为下式所示：
其中，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、甲醇或乙腈，反应温度为20～60℃，反应时间为0.2～4小时，三乙胺，氨水作为催化剂或不加碱性化合物。化合物FD与HOR13、HSR14或NH2R15的投料摩尔比1:0.9～1:5(即1:(0.9～5))。
本发明提供的近红外第二窗口激发和发射的荧光染料，可用于生物体血管等特定部位的靶向成像或对特定分子的检测，并且是易于生物标记的。由于其含有活性基团，如氨基，羧基，叠氮基团，马来酰亚胺基团，琥珀酰亚胺基团等，可修饰到特定蛋白、多肽或DNA上，形成生物标记，从而实现对生物体特定部位的靶向成像或对特定分子的检测。
具体实施方式
实施例1：
七甲川菁荧光探针FD染料的制备。具体步骤如下。
(1)化合物1的合成
称取萘内酰亚胺(170mg,1mmol)与氢化钠(84mg,2mmol)溶于5mL N，N-二甲基甲酰胺,溶液中，室温搅拌15min，随后加入碘乙烷(171mg,1.1mmol)，温度升至80℃，反应12h，冷却至室温后旋干，过柱，得化合物1(184mg,94％)。
(2)化合物2的合成
将萘内酰亚胺(170mg,1mmol)与氢氧化钾(125mg,2mmol)加入10mL N-甲基-2-吡咯烷酮中，室温搅拌30min，随后加入丁磺酸内酯(153mg,1.1mmol)，加热至90℃，反应12h，冷却至室温后加入丙酮，过滤得化合物2(317mg,96％)。
(3)化合物3的合成
将化合物2(300mg,1mmol)与四丁基氯化铵(275mg,1.1mmol)溶于4mL乙酸中，90℃下反应0.5h，加入乙酸乙酯，过滤，旋干，得黄色油状液体，即化合物3(516mg,85％)。
(4)化合物4或5的合成
称取化合物1或3(1mmol)溶于10mL无水四氢呋喃(THF)中，在氮气保护下，加入甲基氯化镁(3.0M的THF),4.5mmol)，60℃反应1h，随后加入稀盐酸，生成沉淀，过滤得化合物4或5。
(5)七甲川菁荧光染料6和7的合成
将化合物4或5(1mmol),与缩合剂Ⅲ(0.5mmol)及乙酸钠(1mmol)溶于20mL乙酸酐中，110度下反应2h，旋干，柱层析分离得黑色固体即化合物6或7。
(6)七甲川菁荧光染料FD-1和FD-2的合成
将化合物6或7(1mmol),与对羟基苯乙酸(5mmol)溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，60度下反应2h，旋干，柱层析分离得固体即化合物FD-1或FD-2。
(7)七甲川菁荧光染料FD-3和FD-4的合成
将化合物FD-1或FD-2(1mmol)，与N-羟基琥珀酰亚胺(5mmol)溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，25度下反应2h，旋干，柱层析分离得固体即化合物FD-3或FD-4。