一种可调谐双发射荧光碳点、制备方法及应用与流程

本发明涉及纳米材料领域，具体涉及双发射荧光碳点及其应用技术。

背景技术：

2006年，孙亚平等人发现碳类似物在简单的表面钝化后显现出与表面氧化的硅纳米晶体类似的光谱特征，并正式将其命名为纳米级碳颗粒(“碳点”)。其后报道的大量文献将碳点定义为近球形、低维度、尺寸小于10nm的光致发光或电致发光的碳纳米粒子碳点。当前已报道的多数碳点在单一波长激发下仅显示一处荧光发射，即单发射荧光碳点，所以据此建立的可视化传感分析方法也只有荧光强弱的变化。然而，人眼对颜色变化的敏感性远大于对亮度变化的敏感性。那么单一波长激发有两处及以上荧光发射的碳点就不失为裸眼直接识别探针的理想选择。

单一波长激发下可见光区有两处荧光发射的双发射碳点可以用作有色调改变的荧光传感器，能够有效克服来自与待测物无关的因素的干扰，从而提高测定方法的准确度和灵敏度。之前文献中的双发射传感器通常需要两种或更多种发光物质结合实现双信号输出(参见中国专利文献：cn108913132a、cn109490269a、cn109294564a、cn109679646a、cn109870438a、cn108489951a、cn106675558b、cn108085711b、cn105911031a)，两种发射体的合成与联结，会大大延长实验周期，并复杂化实验步骤。而目前，已有少数双发射碳点的合成被报道(cn109777405a、cn109777412a、cn108529592a、cn107573930a)，其中一些研究小组热解了相对特殊的有机前体，例如茶叶(cn109777405a)、菠菜(cn109777412a)，复杂的预处理和长制备时间限制了它们的广泛应用和长足发展。针对以上问题，本组已报道的双发射碳点(cn108529592a、cn107573930a)合成周期短，实验步骤简便，但是其发射波长未达到可控调谐的目的，且两发射峰相距较近，可视化效果受限，这也极大地影响了双发射碳点的可控合成和广泛应用。

ph的测定是生化研究的重要组成部分。细胞内ph的变化与许多生理和病理过程密切相关，如酶活性，细胞代谢，增殖，凋亡，肿瘤生长。生物细胞中的异常ph值会导致疾病的发生，例如癌症、糖尿病酮症酸中毒和liddell综合征。目前，与弱酸弱碱分布法、核磁共振法和ph敏感微电极等其他测定方法相比，荧光分析法是一种监测细胞ph值的有效方法。由于荧光碳点生物兼容性好、尺寸小、光稳定性好等诸多优点，基于荧光碳点的可视化传感分析方法具有极大的发展前景。

技术实现要素：

为拓展双发射荧光碳点的合成并解决发射不可调谐的问题，本发明提供一种可调谐的双发射荧光碳点(dual-emissioncarbondots,d-cds)及制备方法，该方法制备的碳点在波长250-400nm激发范围内，可发射出两处明显的荧光发射峰，分别位于可见光区的蓝色波段和绿色波段，并且该碳点可线性传感ph。通过将罗丹明b(rhb)与d-cds简单混合，在可见光区中引入第三处橙色荧光发射，由此成功构建了多色探针。另外，ph敏感的多色探针显示出优异的生物相容性，并最终通过多色荧光成像应用于监测活细胞中的ph值。

为实现上述目的，本发明第一方面是提供一种可调谐的双发射荧光碳点，其由钙黄绿素、氢氧化钠和乙醇溶剂通过溶剂热法合成得到。钙黄绿素和氢氧化钠的物质的量之比为1:12.5-50，乙醇溶剂的加入量使得钙黄绿素的质量浓度等于0.02mol/l，合成温度170-190℃；所述双发射荧光碳点在波长250-400nm激发范围内，可发射出两处明显的荧光发射峰，分别位于可见光区的蓝色波段和绿色波段。所述碳点的双发射荧光峰强度通过改变naoh量或合成时间而达到可控调整目的。

另一方面，本发明还提供上述可调谐的双发射荧光碳点的制备方法，包括以下步骤：

1、取钙黄绿素和氢氧化钠置于密闭反应器中，加入体积比为(0-5):(5-0)的无水乙醇及超纯水做溶剂得反应体系，其中，钙黄绿素和氢氧化钠的物质的量之比为1:12.5-50，所述溶剂的加入量使得钙黄绿素的物质的量浓度等于0.02mol/l。

2、将反应体系升温至170-190℃，反应2-12h；

3、反应体系冷却至室温，盐酸溶液调节ph至中性，离心去除大颗粒，透析冷冻干燥得双发射荧光碳点。

优选的，所述步骤1中，钙黄绿素和氢氧化钠的物质的量比为1:31.25。

优选的，所述步骤1中，乙醇的加入量为5ml，水的加入量为0。

优选的，所述步骤1中，密闭反应器为高压内衬聚四氟乙烯反应釡。

优选的，所述步骤2中，反应温度为180℃。

优选的，所述步骤2中，反应时间为6h。

优选的，所述步骤3所述的透析选用分子截流量为1000(mwco)的透析膜。具体地，所述的透析膜选用纤维素酯透析膜。

优选的，上述双发射荧光碳点在365nm波长激发下，在436nm和530nm处均有荧光发射。

进一步，本发明还提供上述可调谐的双发射荧光碳点的应用，上述双发射荧光碳点结合荧光染料rhb可用于检测细胞内ph值。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供的制备方法简单易操作，原料钙黄绿素和氢氧化钠都具有廉价环保的特点。

2.本发明提供的碳点的双发射荧光峰强度可通过改变合成条件而达到可控调整的目的。具体地，改变naoh量或反应时间，可以定量调整双发射的荧光强度比。如图5的a图、b图所示，随着naoh量的增加，两峰的强度比增强。当氢氧化钠的质量为125mg时，两峰强度比接近1。另外，合成时间增加，两峰强度比也可以有规律地增加。6h作为碳点合成时间时最终获得最佳强度比的所需荧光碳点(图5的c图、d图)。

3.本发明提供的双发碳点与rhb集合于同一体系中，并将成功构建的多色探针可应用于细胞成像，检测胞内ph值的变化。

附图说明

图1是实施例1制备的碳点在365nm激发下的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，插图为不添加氢氧化钠合成碳点的荧光光谱图；

图2是实施例2制备的碳点在365nm激发下的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；

图3是实施例3制备的碳点在365nm激发下的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；

图4是实施例4制备的碳点在365nm激发下的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；

图5是实施例1制备的碳点在365nm激发下的荧光光谱图

a是实施例1制备的碳点在365nm激发下的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；

b是实施例1制备的碳点在365nm激发下两荧光峰强度比的趋势图，横坐标为原料用料，纵坐标为两峰荧光强度比；

c是实施例4制备的碳点在365nm激发下的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度；

d是实施例4制备的碳点在365nm激发下两荧光峰强度比的趋势图，横坐标为反应时间，纵坐标为两峰荧光强度比；

图6是实施例5制备的碳点的扫描透射电镜图，其中插图为粒径统计图；

图7是实施例5制备的碳点的透射电镜图；

图8是实施例5制备的碳点的红外光谱图；

图9是实施例6、7制备的碳点的光谱图

a是实施例6制备的碳点的耐盐性光谱图，横坐标是溶液中氯化钠的浓度，纵坐标是荧光强度；

b是实施例7制备的碳点的光漂白光谱图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；

图10是实施例8制备的多色探针的细胞成像图

a是实施例8制备的多色探针的细胞成像图，横向行代表不同ph，纵向列代表不同通道；

b是实施例8制备的多色探针的细胞成像图的强度柱状图，横坐标为ph，纵坐标为强度比(flgreen+flred)/flblue。

具体实施方式

以下通过是实施例具体详细说明本发明：

实施例中所采用的钙黄绿素、氢氧化钠和无水乙醇均为分析纯规格的市售品。

实施例1原料比例对碳点的影响

准确称量0.1mmol的钙黄绿素及对应的0、1.250mmol、1.875mmol、2.500mmol、3.125mmol、3.750mmol、4.375mmol、5.000mmol的氢氧化钠，将其置于八个盛有5ml无水乙醇的25ml聚四氟乙烯反应釜中；接着，180℃加热反应6h，反应完成后待反应釜自然冷却到室温将产物加水稀释5倍，并利用盐酸溶液调节至中性，离心透析冷冻干燥得碳点固体。

所得碳点固体加水稀释配置成浓度为2.5mg/ml的碳点母液，取200μl，用水定容至1ml，用f-7000荧光分光光度计测其荧光光谱，当激发波长为365nm时得到其荧光光谱图(图1)。如图1所示，当钙黄绿素与氢氧化钠的物质的量之比为1:12.5时，365nm激发下碳点的荧光开始出现明显的双波峰，当原料物质的量之比为1:31.25时，碳点的双发射荧光峰强度均较强且相当，波谷荧光强度相对最低。

实施例2溶剂对碳点的影响

准确称量0.1mmol的钙黄绿素及3.125mmol氢氧化钠各六份于六个分别盛有5ml超纯水、1ml无水乙醇和4ml超纯水的混合溶液、2ml无水乙醇和3ml超纯水的混合溶液、3ml无水乙醇和2ml超纯水的混合溶液、5ml无水乙醇的六个25ml聚四氟乙烯反应釜中，180℃加热反应6h，反应完成后待反应釜自然冷却到室温将产物加水稀释5倍，并利用盐酸溶液调节至中性，离心透析冷冻干燥得碳点固体。

采用与实施例1的相同的方法得到其荧光光谱图(图2)，当以5ml无水乙醇为溶剂时制得的碳点不仅双发射波谷最为明显，且两发射峰荧光强度最为接近。

实施例3反应温度对碳点的影响

分别称量0.1mmol的钙黄绿素及3.125mmol氢氧化钠和5ml无水乙醇三份于三个25ml聚四氟乙烯反应釜中。然后将密闭反应釜放置于鼓风干燥箱中分别在170℃、180℃、190℃反应6h。反应完成后待反应釜自然冷却到室温将产物加水稀释5倍，并利用盐酸溶液调节至中性，离心透析冷冻干燥得碳点固体。

采用与实施例1的相同的方法得到其荧光光谱图(图3)。如图所示，三个温度下合成的碳点均有双发射荧光，且在180℃所合的碳点的两发射荧光强度最相当。

实施例4反应时间对碳点的影响

分别称量0.1mmol的钙黄绿素及3.125mmol氢氧化钠和5ml无水乙醇六份于六个25ml聚四氟乙烯反应釜中。然后将密闭反应釜放置于鼓风干燥箱中在180℃分别反应2h、4h、6h、8h、10h、12h。反应完成后待反应釜自然冷却到室温将产物加水稀释5倍，并利用盐酸溶液调节至中性，离心透析冷冻干燥得碳点固体。

采用与实施例1的相同的方法得到其荧光光谱图(图4)。如图所示，所有时间间隔合成的碳点均显现双发射，且当反应时间为6h时，365nm激发下的双发射峰荧光强度最接近。

实施例5碳点的制备

于聚四氟乙烯反应釜中加入62.3mg钙黄绿素，125mgnaoh，5ml无水乙醇。接着将密闭反应釜置于鼓风干燥箱中180℃加热反应6h。反应完成后待反应釜自然冷却到室温将产物加水稀释5倍，并利用盐酸溶液调节至中性，离心透析冷冻干燥得碳点固体。

用扫描透射电镜(stem)、高分辨率透射电镜(hrtem)及红外光谱仪对最终合成的碳点进行表征，结果分别见图6、图7和图8，碳点颗粒的平均尺寸为2.0nm，粒径分布在1.4-2.8nm范围内。并对荧光碳点进行荧光量子产率的测定，测得结果绝对量子产率为21.9％。

实施例6碳点的耐盐性考察

将实施例5方法制备的碳点加水稀释配置成2.5mg/ml的碳点溶液，于七支离心管中，分别取200μl2.5mg/ml的碳点溶液，再分别向离心管中加入不同浓度的氯化钠溶液用水定容至1ml使得最终盐浓度为0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mol/l，用f-7000荧光分光光度计进行荧光测定，最终实验发现，365nm激发下的两波长处的荧光峰强度几乎无较大变化，结果见图9的a图，表明该碳点有较好的耐盐性。

实施例7碳点的光漂白性考察

将实施例5方法制备的碳点加水稀释配置成2.5mg/ml的碳点溶液，于离心管中，取200μl，加水定容至1ml，用f-7000荧光分光光度计在激发波长为365nm，发射436nm及530nm处进行光漂白实验，最终实验发现，两发射波长处的荧光强度无较大变化，结果见图9的b图，表明该碳点有较为优异的耐光漂白性。

实施例8细胞成像

将实施例5方法制备碳点加水稀释配置成5mg/ml的碳点溶液，接着加入200μmol/l的rhb溶液(终浓度为0.4μmol/l)，涡旋混匀得多色探针储备液。将细胞a549接种到激光共聚焦(或正置显微镜)专用培养皿之中，放置培养皿于恒温培养箱(37℃，5％co2)中培养24h，分别加入探针储备液使探针在培养皿中碳点的浓度达到1mg/ml孵育2h，移除培养上清液，使用pbs缓冲液洗3次，各自加入ph＝5.0，5.5，6.0的pbs缓冲溶液再孵育15min，后于激光共聚焦下成像，观察不同ph下探针的细胞成像获得如图10的a,b图所示的实验结果。随着细胞内ph值的增加，a549细胞的强度(flgreen+flred)/flblue逐渐增加。