[0001]本发明属于探针检测
技术领域：
：，具体涉及一类半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
：：[0002]溶酶体与肿瘤的关系日益引起人们的关注。在细胞内和细胞外的物质循环中以及体内的许多生理过程中溶酶体都起到重要的作用。研究发现溶酶体可以诱导细胞死亡，溶酶体可能会泄露部分水解酶，即溶酶体膜通透(lmp)。lmp在细胞凋亡的早期出现，也是引起细胞凋亡的关键因素之一。[0003]多胺是小分子天然脂肪族胺类，广泛分布于生物体内，其对人体内生理活动具有生物学调控作用。研究发现，多胺的合成、代谢相关的酶的活性明显增高以及其含量增加，一般出现在快速生长和分化的细胞中，所以多胺对细胞的增殖过程和分裂过程有影响,在细胞各项生理功能中起到重要作用。如今各种多胺及其衍生物广泛应用于生物活性研究。多胺衍生物在抗肿瘤方面的应用引起科研工作者广泛的关注，其可能提高对肿瘤细胞的选择性以及化合物生物的活性。[0004]半导体量子点作为荧光探针在分子和细胞成像中的发展引起人们的兴趣。量子点具有量子限域效应，量子限域使其吸收峰和发射颜色可调节。量子点的荧光明亮并且稳定，可以用于医学成像和治疗。由于其独特的光学特性和电子结构，量子点在生物诊断、生物成像、光电子学和传感器等领域的应用越来越广泛。氨基酸是组成蛋白质的基本单位。每种氨基酸分子既含有氨基又含有羧基，可以和纳米材料比如量子点、抗肿瘤药物通过离子键或共价键的形式相连接，提高量子点的水溶性及生物相容性。基于此，本发明研究并提供了一类半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点用作溶酶体靶向荧光探针。技术实现要素：[0005]本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一类半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用。[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0007]一类基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针，其具有如下通式：[0008][0009]其中，n取0，1或2；m取0或1；qds代表量子点。[0010]进一步的，所述量子点为cdse、cdse/zns或cdse/cds等。[0011]本发明提供了上述基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针的制备方法，其将配体溶解于水中，然后加入含量子点的氯仿溶液，用三乙醇胺调节ph值大于10，超声反应2-6h，反应完成时红色的量子点从下层有机相转入上层水相，取上层水相加入乙酸乙酯，离心弃去上清，得到固体沉淀，经洗涤、干燥即得；[0012]所述配体为l-cys-mpampa或l-cys-ampda[0013]进一步的，量子点与配体的质量比为1：9-11。[0014]上述基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针的制备方法中，所述配体[0015]经下述步骤制备获得：[0016]1)将n-(3-氨丙基)吗啉溶于乙腈，加入k2co3和n-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺，反应过夜，蒸出溶剂，加入体积比1:1的ch2cl2和10％na2co3萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得到黄色油状物2；或者将n-(3-氨丙基)吗啉溶于乙腈，加入k2co3和n-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺，反应过夜，蒸出溶剂，加入体积比1:1的ch2cl2和10％na2co3萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得到黄色油状物7；[0017]2)将黄色油状物2或7溶解于甲醇中，加入(boc)2o，室温下搅拌反应过夜，蒸干溶剂，用硅胶柱纯化分离，以体积比20:1的ch2cl2-ch3oh作为洗脱液，蒸干溶剂，得油状物3；[0018]3)将油状物3溶于无水乙醇中，加入水合肼，室温搅拌反应过夜，蒸干溶剂，加入体积比1:1的ch2cl2和10％na2co3萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得中间体4；[0019]4)制备化合物5：[0020]将n-叔丁氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸和n-羟基丁二酰亚胺溶于乙腈中，冰浴条件下，加入1,2-二氯乙烷，搅拌2-4h，然后在n2保护下反应10-16h，过滤，蒸干，加入ch2cl2溶解，用蒸馏水进行萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得白色泡沫状固体化合物12；[0021]将化合物12与中间体4混合，加入nahco3，50-70℃油浴条件下搅拌10-16h，蒸出溶剂，加入适量水溶解，然后加入ch2cl2萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，用硅胶柱纯化分离，以体积比20:1的ch2cl2-ch3oh作为洗脱液，得到黄色油状物中间体化合物5；[0022]5)将化合物5溶于ch2cl2，冰浴条件下抽真空，氮气保护，注入氟乙酸和三乙基硅烷，撤去冰浴，反应4-8h，蒸干溶剂，加入适量水溶解，然后加入二氯甲烷萃取，取水层，蒸出溶剂即得。[0023]上述基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针的制备方法中，所述配体[0024]l-cys-mpa经下述步骤制备获得：[0025]1)将n-叔丁氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸和n-羟基丁二酰亚胺溶于乙腈中，冰浴条件下，加入1,2-二氯乙烷，搅拌2-4h，然后在n2保护下反应10-16h，过滤，蒸干，加入ch2cl2溶解，用蒸馏水进行萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得白色泡沫状固体化合物12；[0026]2)将n-(3-氨丙基)吗啉与化合物12混合，加入nahco3，50-70℃油浴条件下搅拌10-14h，蒸出溶剂，加入体积比1:1的ch2cl2和蒸馏水萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，用硅胶柱纯化分离，以体积比20:1的ch2cl2-ch3oh作为洗脱液，得到黄色油状物中间体13；[0027]3)将中间体13溶于ch2cl2，冰浴条件下抽真空，氮气保护，注入三氟乙酸和三乙基硅烷，撤去冰浴，反应4-8h，蒸干溶剂，用体积1:1的蒸馏水和ch2cl2萃取，取水层，蒸干，即得。[0028]上述基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针的制备方法中，所述配体[0029]l-cys-ampda经下述步骤制备获得：[0030]1)将中间体4溶于乙腈，加入k2co3和n-(3-溴丙基)苯二胺，反应过夜，蒸出溶剂，用体积比1:1的ch2cl2和10％na2co3萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得到黄色油状化合物14；[0031]2)将化合物14溶于甲醇中，然后加入(boc)2o，室温搅拌过夜，蒸干溶剂，用硅胶柱纯化分离，以体积比20:1的ch2cl2-ch3oh作为洗脱液，蒸干得油状化合物15；[0032]3)将化合物15溶于无水乙醇中，加入水合肼，室温搅拌，反应过夜，蒸干溶剂，用体积比1:1的ch2cl2和10％na2co3萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得中间体16；[0033]4)将中间体16与化合物12混合，加入nahco3，50-70℃油浴条件下搅拌10-14h，蒸出溶剂，加入体积比1:1的ch2cl2和蒸馏水萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，用硅胶柱纯化分离，以体积比20:1的ch2cl2-ch3oh作为洗脱液，得到黄色油状物中间体17；[0034]5)将中间体17溶于ch2cl2，冰浴条件下抽真空，氮气保护，注入三氟乙酸和三乙基硅烷，撤去冰浴，反应4-8h，蒸干溶剂，用体积1:1的蒸馏水和ch2cl2萃取，取水层，蒸干，即得。[0035]本发明还提供了上述基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点荧光探针在标识癌细胞溶酶体荧光探针上的应用。[0036]本发明还提供了上述基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点荧光探针在标识正常细胞溶酶体荧光探针上的应用。[0037]和现有技术相比，本发明的有益效果：[0038]1)本发明把半胱氨酸-多胺-吗啉结合在一起，可以改善多胺类化合物的水溶性和生物性能，制成具有生物靶向性的纳米材料，从而实现荧光探针的靶向作用；[0039]2)本发明通过有效的方法将半胱氨酸-多胺-吗啉衍生物修饰到量子点纳米颗粒表面，使得这些荧光量子点纳米颗粒可以特异性地识别细胞，制成具有生物靶向性和特异性高的纳米材料，实现荧光探针的靶向作用，其标记的细胞则可以通过多种检测方法进行检测；[0040]3)本发明基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针的制备方法简单易行，成本较低。附图说明[0041]图1为本发明实施例1中量子点cdse/zns纳米颗粒c(图中a)和修饰的量子点纳米颗粒荧光探针d(图中b)的透射电镜图谱；[0042]图2为本发明实施例制备所得半胱氨酸-多胺-吗啉修饰后的量子点纳米颗粒荧光探针d的紫外吸收图谱；a)中量子点是cdse，b)中量子点是cdse/cds，c)中量子点是cdse/zns；[0043]图3为本发明实施例制备所得半胱氨酸-多胺-吗啉修饰后的量子点纳米颗粒荧光探针d的荧光图谱；a)中量子点是cdse，b)中量子点是cdse/cds，c)中量子点是cdse/zns；[0044]图4为本发明实施例1产品d，cdse/zns@l-cys-mppda与市售的溶酶体探针lysotrackergreen共定位的共聚焦图谱。具体实施方式[0045]以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。[0046]实验仪器名称与型号：[0047]德国brukerav-400型核磁共振仪；[0048]美国pvariancary300bio型紫外可见光谱仪；[0049]美国perkin-elmerls55荧光分光光度计；[0050]日本jeoljem-200cx透射电子显微镜；[0051]德国leicasp5激光共聚焦显微镜。[0052]下述实施例中，所用量子点cdse、cdse/zns或cdse/cds采用本领域常规技术制备即可，如可参考下述文献：[0053]z.a.peng；x.peng.formationofhigh-qualitycdte,cdse,andcdsnanocrystalsusingcdoasprecursor.j.am.chem.soc.2001,123,183-184；[0054]j.j.li；y.a；wang；w.guo；j.c.keay；t.d.mishima；m.b.johnson；x.peng.large-scalesynthesisofnearlymonodispersecdse/cdscore/shellnanocrystalsusingair-stablereagentsviasuccessiveionlayeradsorptionandreaction.j.am.chem.soc.2003,125,12567-12575；[0055]s.pathak；s.-k.choi；n.arnheim；m.e.thompson.hydroxylatedquantumdotsasluminescentprobesforinsituhybridization.j.am.chem.soc.2001,123,4103-4104)。[0056]实施例1[0057]配体为a(l-cys-mppda)，制备基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针时的合成步骤如下：[0058][0059]1)制备化合物2：在100ml圆底烧瓶中，1.4g(10mmol)n-(3-氨丙基)吗啉溶于50ml乙腈，加入2.1g(15mmol)k2co3，分批次加入2.7g(10mmmol)n-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺，反应过夜。蒸出溶剂，ch2cl2和10％na2co3(v:v＝1:1)萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得到黄色油状物2；[0060]2)制备化合物3：圆底烧瓶中加入甲醇50ml溶解化合物2，加入3.3g(15mmol)二碳酸二叔丁酯((boc)2o)，室温下搅拌过夜，蒸干溶剂，用硅胶柱(200-300目)纯化分离，以体积比20:1的ch2cl2-ch3oh作为洗脱液，蒸干溶剂，得油状物3；[0061]3)制备化合物4：将上步得到的化合物3溶于50ml无水乙醇中，向其中加水合肼5ml，室温搅拌，反应过夜。蒸干溶剂，ch2cl2和10％na2co3(v:v＝1:1)萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得中间体4。[0062]4)制备化合物5：在100ml圆底烧瓶中，将0.5g(3.5mmol)化合物12(化合物12制备参见实施例3)与中间体4混合，加入0.35g(4.2mmol)nahco3，60℃油浴条件下搅拌12h，蒸出溶剂，加入适量水溶解，然后加入ch2cl2萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，用硅胶柱(200-300目)纯化分离，以体积比20:1的ch2cl2-ch3oh作为洗脱液，得到黄色油状物中间体5。[0063]5)制备化合物a：在50ml三口瓶中，中间体5溶于10mlch2cl2，冰浴条件下抽真空，氮气保护，注入9.5ml三氟乙酸和0.5ml三乙基硅烷，撤去冰浴，反应6h。溶剂蒸干，加入适量水溶解，然后加入ch2cl2萃取，取水层，蒸出溶剂得半胱氨酸-多胺-吗啉化合物a。[0064]6)制备荧光探针d：取量子点纳米颗粒cdse、cdse/zns或cdse/cds10mg，加1ml氯仿稀释获得量子点氯仿溶液。100mg半胱氨酸-多胺-吗啉化合物a溶于1ml三蒸水，加入量子点氯仿溶液中。滴管加入10滴三乙醇胺调节ph大于10，室温超声反应4h，反应完成时红色的量子点从下层有机相转入上层水相，取上层水相加入乙酸乙酯析出沉淀，离心弃去上清，得固体沉淀，用三蒸水洗涤3次，离心，上清液倒掉，沉淀放在真空干燥箱中干燥，得到水溶性半胱氨酸-多胺-吗啉衍生物修饰的量子点d。[0065]利用透射电镜对cdse/zns量子点及半胱氨酸-多胺-吗啉修饰后cdse/zns量子点的大小、分散程度的表征，结果见图1。图1可以看出：修饰前后量子点的分散性都很好，粒径均匀，为球形。[0066]实施例2[0067]配体为b(l-cys-mbbda)，制备基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针时的合成步骤如下：[0068][0069]1)制备化合物7：在100ml圆底烧瓶中，将1.4g(10mmol)n-(3-氨丙基)吗啉溶于50ml乙腈，加入2.1g(15mmol)k2co3，分批次加入2.8g(10mmmol)n-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺6，反应过夜。蒸出溶剂，ch2cl2和10％na2co3(v:v＝1:1)萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得到黄色油状物7；[0070]2)制备化合物8：参照实施例1化合物3的制备方法；[0071]3)制备化合物9：参照实施例1化合物4的制备方法。[0072]4)制备化合物10：参照实施例1化合物5的制备方法。[0073]5)制备化合物b：参照实施例1化合物a的制备方法。[0074]6)制备荧光探针d：参照实施例1。[0075]实施例3[0076]配体为l-cys-mpa制备基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针时的合成步骤如下：[0077][0078]1)制备化合物12：称取2.0g(3.5mmol)化合物11(n-叔丁氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸)溶于100ml乙腈在250ml圆底烧瓶中，向其中加入0.59g(3.5mmol)n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，冰浴条件下，向其中加入0.89g(3.5mmol)1,2-二氯乙烷(edc)，搅拌2h，然后在n2保护下反应12h，过滤，蒸干，向其中加入50mlch2cl2溶解，用蒸馏水进行萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得白色泡沫状固体12。[0079]2)制备化合物13：在100ml圆底烧瓶中，将0.5g(3.5mmol)n-(3-氨丙基)吗啉与中间体12混合，加入0.35g(4.2mmol)nahco3，60℃油浴条件下搅拌12h，蒸出溶剂，ch2cl2和蒸馏水(v:v＝1:1)萃取，取有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，用硅胶柱(200-300目)纯化分离，以体积比20:1的ch2cl2-ch3oh作为洗脱液，得到黄色油状物中间体13。[0080]3)制备化合物b2：在50ml三口瓶中，中间体13溶于10mlch2cl2，冰浴条件下抽真空，氮气保护，注入9.5ml三氟乙酸和0.5ml三乙基硅烷，撤去冰浴，反应6h。溶剂蒸干，用蒸馏水和ch2cl2(v:v＝1:1)萃取，取水层，蒸干，得化合物b2。[0081]6)制备荧光探针d：参照实施例1。[0082]实施例4[0083]配体为l-cys-ampda制备基于半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针时的合成步骤如下：吗啉修饰的量子点纳米颗粒的荧光和溶酶体探针lysotrackergreen的图像几乎完全重合，因此修饰后的量子点可以靶向细胞的溶酶体。[0093]活性实验[0094]细胞培养：hela(宫颈癌细胞)，hepg2(肝癌细胞)和smmc-7721(人肝癌细胞)，细胞用含10％(v/v)胎牛血清且含1％(v/v)青链霉素混合液的1640培养基于培养瓶中培养。培养瓶置于37℃、含5％co2且湿度为90％的培养箱中进行培养。[0095]细胞毒性测试：实施例1至4制备得到的半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针d在hela、hepg2和smmc-7721细胞中的细胞毒性采用mtt法测定：细胞传代培养3、4次后，当细胞生长到对数期时，将细胞用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，采用血球计数板进行活细胞计数，调整活细胞浓度为5×104/ml接种于96孔培养板中，每孔100μl，于37℃、含5％co2且湿度为90％的培养箱中培养24h后，吸出旧培养基，再分别加入用培养基稀释的不同浓度的实施例1至4制备得到的产物d样品。加入样品后的96孔板置于37℃、含5％co2的培养箱中孵育48h，然后加入mtt20μl/孔(2.5mg/ml)，4h后弃上清液，加入dmso100μl/孔，振荡10min左右，用m200酶标仪测定od值，波长设置为570nm和690nm双波长。没有加入样品的孔的细胞存活率作为对照，设为100％，计算细胞存活率，评价样品的细胞毒性。结果见下表1。[0096]表1实施例1至4制备得到的产物d的细胞毒性[0097][0098][0099]表1测试了实施例1至4制备得到的半胱氨酸-多胺-吗啉修饰的量子点溶酶体靶向荧光探针d对hela，hepg2和smmc-7721细胞的体外生长抑制活性。ic50值为能使正常分裂生长的细胞数抑制到50％水平时的样品浓度值(μg/ml)，ic50值越大表明样品的细胞毒性越弱。[0100]实验结果表明：本发明基于量子点纳米颗粒的细胞溶酶体荧光探针，即半胱氨酸-多胺-吗啉衍生物修饰的量子点d对细胞的毒性比较小，可以作为靶向性细胞溶酶体荧光探针使用。当前第1页1 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