一种农药荧光标记成像材料及其制备方法和应用

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种农药荧光标记成像材料及其制备方法和应用。

背景技术：

导向农药是现代农业用于防治病虫害而研发的新型药物，其特点为能够在植物体内定向转运，最终在病虫危害部位富集，达到施药减量增效的目的。目前部分导向农药已通过在氟虫腈、氯虫苯甲酰胺等传统农药结构中修饰氨基酸得到，而对导向药物在植物体内吸收、转运、以及分布情况的表征是阐明导向农药作用原理的重要依据。迄今为止可直接对植物体内农药分布实现可视化观察的成像技术仍非常有限，因此，开发可原位标记植物体内农药的成像材料是推动导向农药发展的一项重要研究内容。

荧光标记成像是利用分子级或纳米级的荧光探针产生的荧光信号对生物体内特定部位或底物进行造影的技术。该分析技术已被广泛应用于临床医学中的影像检查和手术导航，在植物组织荧光成像方面也已有相关报道。尽管已有荧光探针种类繁多，且大多具备灵敏度高、时间及空间分辨率高、可视化等优势，但在导向农药荧光标记成像方面，由于直接在农药结构上经化学反应共价修饰荧光基团可能引起农药分布变化，对准确分析导向农药分布转运性质造成不利影响，因此在设计用于农药荧光标记成像的新型材料时应尽可能保持原有农药结构不变，即非共价修饰的成像材料。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种农药荧光标记成像材料及其制备方法和应用，具体提供了基于蛋白-配体超分子作用的农药荧光标记成像材料，通过制备血清蛋白结合荧光探针用于观测农药在植物体内的分布，解决共价修饰荧光基团的农药可能存在的结构改变引起分布变化问题。

蛋白-配体作用是一种基于亲疏水、氢键等非共价结合的超分子作用，不同于共价修饰直接改变被修饰分子结构，蛋白与小分子配体结合后配体结构基本保持不变。血清蛋白是广泛存在于禽类、哺乳动物体内的一种载体蛋白，已有报道指出血清蛋白可与药物、农药、荧光染料等有机小分子形成主客体复合物。利用不同客体小分子与主体蛋白的结合力差异可实现配体置换，如以强结合力的农药置换弱结合力的荧光染料，可产生荧光信号变化，实现对农药的荧光标记。

因此，本发明的第一个目的是提供一种农药荧光标记成像材料的制备方法，包括以下步骤：

s1.将荧光探针溶解于有机溶剂配制荧光探针母液，将血清蛋白溶解于pbs缓冲液配制血清蛋白母液；

s2.以pbs缓冲液稀释血清蛋白母液，在振荡条件下滴入荧光探针母液，振荡后静置得到蛋白-荧光探针溶液a；

s3.将蛋白-荧光探针溶液a用去离子水透析后冻干，得到农药荧光标记成像材料。

优选，所述的荧光探针为香豆素、荧光素、黄酮或查尔酮类化合物。荧光探针为含羰基的荧光分子。

更优选的，所述的荧光探针为查尔酮4mc。查尔酮4mc采用395nm激发。

优选，所述的血清蛋白为人血清蛋白、牛血清蛋白、鸡血清蛋白、猴血清蛋白、鼠血清蛋白或猪血清蛋白。

优选，所述的有机溶剂为dmso、thf或dmf；所述的pbs缓冲液为ph7.4的pbs缓冲液。

优选，所述的荧光探针母液浓度为10～100mmol/l，血清蛋白母液浓度为33～66mg/ml。

优选，所述的步骤s2具体如下：以pbs缓冲液稀释血清蛋白母液至血清蛋白浓度为10μm，在2500rpm振荡条件下滴入荧光探针母液，滴入体积小于混合体系总体积的5％，继续振荡1min后静置2min得到蛋白-荧光探针溶液a。

本发明的第二个目的是提供根据所述的农药荧光标记成像材料的制备方法制备得到的农药荧光标记成像材料。

本发明的第三个目的是提供所述的农药荧光标记成像材料在农药标记成像中的应用。尤其是在生物体或其离体组织内的农药标记成像中的应用。

优选，所述的应用，为在植物或其离体组织中农药标记成像中的应用，包括以下步骤：将农药荧光标记成像材料添加到植物培养液中然后用于植物或其离体组织的培养，待植物或其离体组织中充分吸收农药荧光标记成像材料后，替换为添加了农药的植物培养液继续培养；过程中拍摄植物或其离体组织的荧光照片观察成像情况。

利用上述方法制备的农药荧光标记成像材料，通过荧光光谱仪测定荧光探针在与蛋白结合后仍具有较强荧光强度；通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察在植物体内的成像情况。

有益效果：

本发明方法选择成本较低且具有载药功能的血清蛋白，利用超分子作用以蛋白包裹有机荧光探针得到均一溶液，该溶液可直接用于生物组织培养进行荧光成像，冻干后可得到农药荧光标记成像材料。本发明创造性地利用蛋白-配体超分子作用，以血清蛋白为主体、荧光探针为客体形成均一稳定的复合物，进而利用农药与血清蛋白之间更强的结合力，以农药置换蛋白内部的荧光探针产生荧光信号变化，实现对植物体内农药分布的原位观测。

本发明有助于分析表征农药在植物体内的分布情况，特别可为导向农药的吸收、转运、富集过程提供重要实验依据，从而指导导向农药设计及输导机理研究。

本发明可以根据农药与蛋白的结合力灵活更换不同种类的血清蛋白，具有广泛的使用范围。

本发明提供的荧光标记成像材料具有制备方法简单、生物毒性低、体系组成灵活可控的优点，可拓展至植物体内其它底物的荧光分析、监测、标记、示踪等研究。

附图说明

图1为本发明的模式图。

图2为实施例1的荧光成像图。

图3为查尔酮4mc的结构表征数据。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

关于以下实施例中涉及的荧光探针查尔酮4mc说明如下：

查尔酮4mc(其结构式如式i所示)为自行制备得到，

式i化合物的制备步骤如下：

将4-甲氧基邻羟基苯乙酮与对二甲氨基苯甲醛溶解于乙醇与水的混合溶剂中，其中水含量30～50wt％，加入naoh水溶液(10～20wt％)10ml，在25～80℃下搅拌18～24h，将反应液倒入1000ml水中加酸中和，经重结晶得到4mc。化合物结构表征数据如图3所示。

本发明提供基于蛋白-配体超分子作用的农药荧光标记成像材料及其制备方法。本方法模式图如图1所示，蛋白与荧光探针结合后产生初始荧光信号，如荧光点亮“flon”、荧光猝灭“floff”、特定发光颜色“蓝绿光”；然后与农药结合后荧光探针被置换导致微环境变化，此时对应荧光信号发生“on→off”、“off→on”、“ratiometric”的变化；记录荧光信号变化可实现对农药的标记及荧光成像。由上述内容总结本发明实现农药荧光标记的作用原理为：农药与血清蛋白的结合强于荧光探针与蛋白的结合，农药置换原本处于蛋白内部的荧光探针并产生荧光信号变化，以此实现对农药的标记及荧光成像。为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明实施例公开一种农药荧光标记成像材料的制备方法，包括以下步骤：

a.将2.8mg查尔酮4mc(其结构式如式i所示)溶于5mldmso得到荧光探针母液，将66mg人血清蛋白溶于1mlpbs缓冲溶液(0.1x,ph＝7.4)得到蛋白母液；

b.移取20μl蛋白母液、10μl荧光探针母液至2mlpbs缓冲溶液(0.1x,ph＝7.4)，2500rpm振荡1min后静置2min得到溶液a；

c.将溶液a以去离子水透析2天后冻干得到荧光标记成像材料hsa-4mc。

应用上述制备的荧光标记成像材料hsa-4mc成像：

荧光成像实验中，取上述制备的荧光标记成像材料hsa-4mc，以含培养液(花无缺)10％的pbs缓冲溶液(即将培养液、pbs缓冲溶液以体积比10％：90％混合的混合液)为溶剂配制含荧光标记成像材料hsa-4mc的溶液b。实验组以含荧光标记成像材料hsa-4mc的溶液b培养水稻植株2h，然后更换为含培养液10％的pbs缓冲溶液(即将培养液、pbs缓冲溶液以体积比10％：90％混合的混合液)并加入氟虫腈100ppm继续培养，分别在加入农药培养0、20、40、60min后拍摄根部荧光照片。如图2所示，以含荧光标记成像材料hsa-4mc的溶液b培养2h后得到根部均匀发光的照片，说明该荧光成像材料可用于点亮植株根部；给药后维管束内、外荧光逐渐猝灭，培养时间1h后荧光仅在维管束边缘保留，该结果给出可视化的药物根部吸收过程。