一种化学发光组合物和调节化学发光的方法

1.本发明涉及化学发光检测领域，具体来说，本发明提供了化学发光组合物以及使用该组合物进行发光时间、发光颜色的调节和形成化学发光图案的方法。


背景技术：

2.化学发光(cl)是一种由化学反应伴随的发光现象，其在冷光源、生物分析、生物传感、报告基因、生物成像、生物图谱等诸多领域具有广泛的应用。但是迄今为止报道的cl技术仍然存在一些显著的缺陷有待解决,例如化学发光通常需要在碱性条件下进行，而碱性条件将会极大的限制其应用范围；产生的光强度偏低，在一些应用中无法进行有效的观察或识别，无法满足相关的技术要求；大部分已知的cl反应都是闪光型发射，在将各组分混合后，cl反应便会立刻发生产生发光，并且发光过程过快，发光时间极短，往往仅在数秒、数分钟内就结束了。精确地控制反应时间是一项非常困难的工作，限制了cl在生物分析、生物传感和生物成像等方面的应用。例如，如果以手动的方式将cl试剂与共反应物混合来引发cl反应，重现性差，严重影响化学发光分析精密度和准确度。因此，化学发光分析中多使用自动注射器和流体动注射技术来操控cl反应的发生，以此来改善分析的重现性。近来微流体辅助的cl系统也已经有了快速的发展，这些cl系统中包括预先设计的通道，能够将多个分析步骤集成化,并且能够以自动化的方式控制少量样品和共反应物流入检测区域。尽管这些技术在尝试使用一些自动化手段来控制cl发光的局域和时机，但是这些自动化手段毫无例外需要采用复杂的装置，而且液体混合过程中的回流和扩散对信号产生的干扰也难以避免。另外，大多数检测技术需要对样品逐个进行分析，难以同时记录多个cl信号，实现对多种样品的一次性检测。
3.因此，本领域科研人员们迫切希望开发一种新的cl技术，其能够在中性条件下实现极高的发光强度和非瞬时的发光，更进一步还希望能够对cl的发光起始时间、发光颜色进行有效的调节，从而实现可控的发光曲线、发光图案或多种发光颜色。迄今为止，现有技术尚未报道任何一种能够实现以上效果的技术新进展。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的发明人进行了深入的研究，成功地开发出一种新颖的化学发光组合物，通过基于碳酸盐的缓冲剂与金属离子的组合在中性条件下实现极高的发光强度和非瞬时的发光，在此基础上进一步开发了准确而简单的调控cl起始时间的新技术，另外还能够采用发光起始时间调节剂通过起始时间调控和荧光共振能量转移所带来的多种颜色发光实现复杂的cl图案。本发明的技术至少能够实现以下优点：操作简单，cl条件呈中性,生物毒性低,发光强度高，发光时间延长，发光起始时间可控，能够非常好地适用于各种用途，例如生物样品分析和成像,用来设计新型cl系统和检测装置，能够用于信号通讯和加密技术。
5.根据本发明的第一个方面，提供了一种化学发光组合物，该组合物包含：
6.(i)发光体化合物；
7.(ii)金属离子，所述金属离子包括：mn
2+
、co
2+
、cr
3+
、fe
2+
、aucl
4-、fe
3+
、ce
3+
、cu
2+
、ni
2+
、pb
2+
、及其任意组合；
8.(iii)h2o2；和
9.(iv)基于碳酸盐的缓冲剂；
10.所述化学发光组合物处于水溶液中或者负载在固体载体的表面上。
11.根据本发明第一个方面的一个实施方式，所述组合物还包含：(v)发光起始时间调节剂，其选自：硫脲类化合物，c
4-c
16
糖醇，c
3-c
12
烷基单醇、二醇或三醇，含有一至四个羟基的c
6-c
16
芳族羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，砜类化合物，亚砜类化合物，哌啶类化合物，c
6-c
16
芳族胺类化合物，苯醌类化合物，超氧化物歧化酶(sod)，含有至少一个烯基的c
6-c
16
芳烃，苯硝酮类化合物，含有一至四个羟基以及至少一个烯基的c
6-c
16
羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，含有一至四个羟基以及至少一个烯基的c
6-c
16
环烷基羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，含有一至四个羟基的c
6-c
16
芳族羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，含有一至六个羟基的c
6-c
16
酚类化合物，含有一至六个羟基的c
6-c
16
芳族胺类化合物，氨基酸，肽，及其任意组合。
12.根据本发明第一个方面的另一个实施方式，所述发光起始时间调节剂选自：硫脲、乙烯硫脲、氨基硫脲、2-甲基-3-氨基硫脲、甘露糖醇、叔丁醇、异丙醇、苯甲酸、二甲亚砜(dmso)、四甲基哌啶(tempo)、二苯胺、对苯醌、超氧化物歧化酶(sod)、1,1-二苯乙烯、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht)、叔丁基苯硝酮(pbn)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo)、抗坏血酸、异抗坏血酸、抗坏血酸磷酸盐、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸葡糖苷、没食子酸、焦性没食子酸、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻苯三酚、间苯三酚、均苯三酚、苯四酚、邻苯二胺、对苯二胺、间苯二胺、儿茶素、多巴胺、半胱氨酸、谷胱甘肽、及其任意组合。优选包括硫脲、乙烯硫脲、氨基硫脲、2-甲基-3-氨基硫脲、抗坏血酸、没食子酸、焦性没食子酸、邻苯二酚、对苯二酚、邻苯二胺、对苯二胺、儿茶素、多巴胺、半胱氨酸、谷胱甘肽、及其任意组合。
13.根据本发明第一个方面的一个实施方式，当所述化学发光组合物处于水溶液中时，所述化学发光组合物还包含(v)基于碳酸盐的缓冲剂。
14.根据本发明第一个方面的另一个实施方式，所述发光化合物包括有机发光体化合物和无机发光体化合物，所述有机发光体化合物包括荧光素类(其可以包括荧光黄、赤藓红、曙红、焰红)发光体、噁二唑类发光体、三唑类发光体、罗丹明类发光体、香豆素类发光体、1,8-萘酰亚胺类发光体、吡唑啉类发光体、三苯胺类发光体、聚三苯胺类发光体、卟啉类发光体、聚卟啉类发光体、咔唑类发光体、聚咔唑类发光体、吡嗪类发光体、噻唑类发光体、苝类发光体、聚苯类发光体、聚噻吩类发光体、聚芴类发光体、聚三苯基胺类发光体、聚吡咯类发光体、聚卟啉[8]类发光体、氟化硼络合二吡咯甲川(bodipy)类发光体、量子点类发光体、海萤萤光素(cla)类发光体、腔肠素荧光素(ctz)类发光体、水母发光蛋白类发光体、过氧化草酸酯类发光体、金刚烷类发光体、二氧杂环丁烷类发光体、2-甲基-6-(4-甲氧苯基)-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-酮盐酸盐(mcla)类发光体、光泽精、吖啶酯类发光体、络吩碱(lophine)类发光体、邻菲罗啉类发光体、没食子酸类发光体、n-溴代琥珀亚酰胺发光体、吡啶核苷酸黄素类发光体、式(1)所示的化合物或其盐、以及式(2)所示的化合物或其盐，
[0015][0016]
在式(1)中，a环表示c
6-c
14
芳环，
[0017]
r1和r2独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(c
1-c
30
)烷基，前提是该nr1r2具有至少一个nh2端基；
[0018][0019]
在式(2)中，r3、r4和r5独立地表示c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、c
6-c
16
芳基、c
6-c
16
芳氧基、f、cl、br、i、-nh2、-oh、-no2、-cooh、-c(＝o)-c
1-c6烷基、及其任意组合；
[0020]
所述无机发光体化合物包括钌离子络合物发光体、铱离子络合物发光体、无机盐类发光体(其包括铁氰化钾、高锰酸盐、重铬酸盐、溴酸盐、碘酸盐、高碘酸盐、铈(iv)盐、亚硫酸盐、碳化氮)、无机气体类发光体(其包括二氧化硫、二氧化碳)、或其任意组合。
[0021]
根据本发明第一个方面的另一个实施方式，所述金属离子包括：mn
2+
、co
2+
、及其组合。更优选包括mn
2+
。
[0022]
根据本发明第一个方面的另一个实施方式，所述基于碳酸盐的缓冲剂是含有二氧化碳、碳酸钠和碳酸氢钠的水溶液，或者含有二氧化碳和碳酸氢钠的水溶液，或者含有碳酸氢钠的水溶液。
[0023]
本发明的第二个方面提供了一种对化学发光进行起始时间调节的方法，该方法包括：向本发明的化学发光组合物中添加发光起始时间调节剂，所述发光起始时间调节剂选自：硫脲类化合物，c
4-c
16
糖醇，c
3-c
12
烷基单醇、二醇或三醇，含有一至四个羟基的c
6-c
16
芳族羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，砜类化合物，亚砜类化合物，哌啶类化合物，c
6-c
16
芳族胺类化合物，苯醌类化合物，超氧化物歧化酶(sod)，含有至少一个烯基的c
6-c
16
芳烃，苯硝酮类化合物，含有一至四个羟基以及至少一个烯基的c
6-c
16
羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，含有一至四个羟基以及至少一个烯基的c
6-c
16
环烷基羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，含有一至四个羟基的c
6-c
16
芳族羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，含有一至六个羟基的c
6-c
16
酚类化合物，含有一至六个羟基的c
6-c
16
芳族胺类化合物，氨基酸，肽，及其任意组合。
[0024]
根据本发明第二个方面的另一个实施方式，所述发光起始时间调节剂选自：硫脲、乙烯硫脲、氨基硫脲、2-甲基-3-氨基硫脲、甘露糖醇、叔丁醇、异丙醇、苯甲酸、二甲亚砜
(dmso)、四甲基哌啶(tempo)、二苯胺、对苯醌、超氧化物歧化酶(sod)、1,1-二苯乙烯、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht)、叔丁基苯硝酮(pbn)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo)、及其任意组合。优选包括硫脲、乙烯硫脲、2-甲基-3-氨基硫脲、抗坏血酸、异抗坏血酸、抗坏血酸磷酸盐、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸葡糖苷、没食子酸、焦性没食子酸、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻苯三酚、间苯三酚、均苯三酚、苯四酚、邻苯二胺、对苯二胺、间苯二胺、儿茶素、多巴胺、半胱氨酸、谷胱甘肽、及其任意组合。
[0025]
根据本发明第二个方面的另一个实施方式，通过向多份所述化学发光组合物中添加不同量或不同种类的所述发光起始时间调节剂，产生由不同化学发光构成的图案。
[0026]
根据本发明第二个方面的另一个实施方式，通过向包含不同发光体化合物的多份所述化学发光组合物中添加所述发光起始时间调节剂，产生由不同化学发光构成的图案。
[0027]
本发明的第三个方面提供了一种产生多种颜色的化学发光的方法，该方法包括，使用本发明的化学发光组合物，该组合物包含多种发光体化合物，并且所述多种发光体化合物之间发生荧光共振能量转移，由此产生多种颜色的化学发光。
附图说明
[0028]
在接下来的段落中结合附图对本发明的各种实施方式进行论述。但是此处需要指出的是，附图中所示和以下具体描述的实施方式仅仅是本发明的一些优选实施方式，本发明的保护范围由权利要求书来限定，而非仅限于这些优选的实施方式。
[0029]
图1a和图1b显示了根据本发明一些实施方式，不同金属离子浓度条件下的cl曲线。
[0030]
图2显示了根据一个对比例，在不使用金属离子条件下的cl曲线。
[0031]
图3显示了根据一个对比例，在利用其他的缓冲剂代替碳酸盐缓冲剂条件下的cl曲线。
[0032]
图4a和图4b分别显示了根据一个实施方式，使用不同金属离子条件下获得的cl照片。
[0033]
图5a显示了根据本发明的一个实施方式，硫脲浓度与cl发光起始时间的关系图，图5b显示了硫脲浓度的对数与cl发光延迟时间的对数的关系图。
[0034]
图6a和图6b分别显示了根据一个实施方式，使用不同硫脲浓度条件下获得的cl照片。
[0035]
图7显示了根据一个实施方式，使用不同硫脲浓度条件下获得的cl照片和对应的编码。
[0036]
图8a至图8c分别显示了根据本发明一个实施方式，分别使用乙烯硫脲、氨基硫脲和2-甲基-3-氨基硫脲实现的cl发光起始时间的调节。
[0037]
图9a至图9b分别显示了根据本发明一个实施方式，使用硫脲针对不同的化学发光体有机分子实现的cl发光起始时间的调节。
[0038]
图10a至图10c分别显示根据本发明一些实施方式，利用多种有机发光体化合物的fret实现的多色发光效果。图10d显示了基于fret实现的彩色发光梯度的cl照片。
[0039]
图11a至图11c分别显示根据本发明一些实施方式，利用多种有机发光体化合物的fret实现的多色彩cl发光连续变化的图案。
[0040]
图12显示了根据本发明一个实施方式，负载在固体载体上的cl体系在硫脲作用下的化学发光起始时间的调节作用。
[0041]
图13a至13f显示了根据本发明另一些实施方式，负载在固体载体上的cl体系在邻苯二酚、没食子酸、多巴胺、焦性没食子酸、邻苯二胺和抗坏血酸作用下的化学发光起始时间的调节作用。
[0042]
图14a至图14c显示了根据本发明另一些实施方式，负载在固体载体上的cl体系在儿茶素、对苯二胺和对苯二酚作用下的化学发光起始时间的调节作用。
[0043]
图15a和图15b显示了根据本发明另一些实施方式，负载在固体载体上的cl体系在半胱氨酸和谷胱甘肽作用下的化学发光起始时间的调节作用。
具体实施方式
[0044]
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。
[0045]
在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
[0046]
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
[0047]
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
[0048]
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，但是优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤(a)和(b)，表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b)，也可以包括顺序进行的步骤(b)和(a)。例如，所述提到所述方法还可包括步骤(c)，表示步骤(c)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c)，也可包括步骤(a)、(c)和(b)，也可以包括步骤(c)、(a)和(b)等。
[0049]
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的“包括”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”可以表示还可以包含没有列出的其他组分，也可以仅包括列出的组分。
[0050]
根据本发明的一个实施方式，本发明记载的化学发光组合物包含：(i)发光体化合物；(ii)金属离子，所述金属离子包括：mn
2+
、co
2+
、cr
3+
、fe
2+
、aucl
4-、fe
3+
、ce
3+
、cu
2+
、ni
2+
、pb
2+
、及其任意组合；(iii)h2o2；和(iv)基于碳酸盐的缓冲剂；所述化学发光组合物处于水溶液中或者至少部分地负载在固体载体的表面上。通过该特别设计的组成能够有效地实现发光强度的提高和发光持续时间的延长。
[0051]
根据本发明的一个实施方式，所述化学发光组合物处于水溶液中，在此情况下所述化学发光组合物的所有组分，包括所述(iv)基于碳酸盐的缓冲剂在内，均处于水溶液中。
萘酰亚胺类发光体、吡唑啉类发光体、三苯胺类发光体、聚三苯胺类发光体、卟啉类发光体、聚卟啉类发光体、咔唑类发光体、聚咔唑类发光体、吡嗪类发光体、噻唑类发光体、苝类发光体、聚苯类发光体、聚噻吩类发光体、聚芴类发光体、聚三苯基胺类发光体、聚吡咯类发光体、聚卟啉[8]类发光体、氟化硼络合二吡咯甲川(bodipy)类发光体、量子点类发光体。
[0054]
根据本发明的一个实施方式，所述有机发光体化合物包括式(1)或式(2)所示的化合物。根据本发明的另一个的实施方式，式(1)或式(2)所示的化合物与一种或多种以上所述的受体发光体组合起来，用作复合fret体系。根据本发明的另一个的实施方式，在所述通式(1)的化合物中，a环是苯环或萘环，且-nr1r2部分是氨基或n-(氨基c
1-c6亚烷基)n-(c
1-c6烷基)氨基；更优选a环是苯环，且-nr1r2部分是氨基、n-(4-氨基丁基)n-(乙基)氨基或(n-4-氨基己基)(n-乙基)氨基。根据本发明的另一个实施方式，特别优选式(i)的化合物具有以下所示的结构：
[0055][0056]
根据本发明的另一个的实施方式，在所述通式(2)的化合物中，r3包括c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、c
6-c
16
芳基、c
6-c
16
芳氧基、f、cl、br、i、-nh2、-oh、-no2、-cooh、-c(＝o)-c
1-c6烷基、及其任意组合；优选r3表示c
1-c3烷基、c
1-c3烷氧基或c
6-c
12
芳基；更优选r3表示苯基、苄基或甲苯基。
[0057]
根据本发明的另一个的实施方式，在所述通式(2)的化合物中，r4和r5各自独立地包括c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、f、cl、br、i、-nh2、-oh、-no2、及其任意组合；优选r4和r5各自独立地包括c
1-c3烷基、c
1-c3烷氧基、cl、-nh2、-oh、-no2、及其任意组合；更优选r4和r5各自独立地表示cl或-nh2。
[0058]
上述有机发光体化合物可以直接从商业途径购买或者根据文献方法制得。例如在以下本发明的一些实施例中使用了商业产品l012，其对应于式(2)的化合物，其中r3为苯基，r4为-nh2，r5为cl。但是可用于本发明的有机发光体化合物不限于此，上文列出的其他有机发光体化合物也可以用于本发明，并实现相同或类似的技术效果。
[0059]
根据本发明的一个实施方式，以所述化学发光组合物的总重量为基准计，所述有机发光体化合物的含量为0.01-10.0重量％，或者为0.02-9.0重量％，或者为0.03-8.0重量％，或者为0.04-7.0重量％，或者为0.05-6.0重量％，或者为0.06-5.0重量％，或者为0.05-2.0重量％，或者为0.1％-1.5重量％，或者为0.2％-1.2重量％，或者为0.4％-1.0重量％，或者为0.5％-0.8重量％。
[0060]
根据本发明的一个实施方式，用于所述化学发光组合物的金属离子包括：mn
2+
、co
2+
、cr
3+
、fe
2+
、aucl
4-、fe
3+
、ce
3+
、cu
2+
、ni
2+
、pb
2+
、及其任意组合；优选包括mn
2+
、co
2+
、及其组合；最优选为mn
2+
。这些金属离子可以以常规的可溶性盐的形式添加入本发明的化学发光组合物中，例如其相应的硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐、硝酸盐等等。
[0061]
根据本发明的一个实施方式，以所述化学发光组合物的总重量为基准计，所述阳离子的含量为0.01-5重量％，或者为0.02-4重量％，或者为0.03-3重量％，或者为0.04-2重
量％，或者为0.05-1重量％，或者为0.06-0.8重量％，或者为0.07-0.5重量％，或者为0.08-0.2重量％，以该阳离子的盐的固体重量计。
[0062]
根据本发明的一个实施方式，本发明的化学发光组合物中使用的基于碳酸盐的缓冲剂包括碳酸盐、碳酸氢盐或其混合物，或者是含有二氧化碳和碳酸氢盐的水溶液，或者是同时含有二氧化碳、碳酸盐和碳酸氢盐的水溶液，优选其中二氧化碳在水溶液中饱和。根据本发明的一个实施方式，所述碳酸盐和碳酸氢盐分别包括常规的可溶性盐，例如铵盐、锂盐、钠盐、钾盐、有机胺盐等，优选是钠盐或钾盐。
[0063]
根据本发明的另一个实施方式，通过采用所述基于碳酸盐的缓冲剂，使得本发明的化学发光组合物的ph值为6.5至8.5，例如为7.0至8.0，或者为7.2至7.5。所述缓冲剂体系中的碳酸盐在上述ph范围内必然是碳酸盐/碳酸氢盐的混合物，可以通过在溶液体系内采用适当的碳酸盐/碳酸氢盐/二氧化碳(碳酸)的比例而获得以上所述的ph值。
[0064]
根据本发明的一个实施方式，以所述化学发光组合物的总重量为基准计，所述碳酸盐和碳酸氢盐二者的总含量为36.2-70.5重量％，例如为38-68重量％，或者为40-65重量％，或者为42-63重量％，或者为45-61重量％，或者为48-60重量％，或者为50-58重量％，或者为52-56重量％，或者为53-54.4重量％。
[0065]
根据本发明的一个事实方式，所述化学发光组合物仅包含基于碳酸盐的缓冲剂，而不使用其他的缓冲剂。
[0066]
根据本发明的一个实施方式，以所述化学发光组合物的总重量为基准计，所述h2o2的含量为3.9-75.9重量％，例如为5-72重量％，或者为8-70重量％，或者为10-65重量％，或者为15-62重量％，或者为20-60重量％，或者为25-55重量％，或者为30-52重量％，或者为35-50重量％，或者为40-48重量％，或者为42-44.1重量％。此处所述的“h2o2的含量”表示过氧化氢的净重量，而不包括双氧水溶液中的水的量。
[0067]
在本发明中，除非另外说明，所述“化学发光组合物的总重量”指的是所述组分(i)-(v)以及任意其他任选组分的总重量，但是不包括水和任意其他溶剂。
[0068]
根据本发明的一个实施方式，本发明的化学发光组合物在使用的时候可以将其所有的组分溶解或分散在溶剂中，所述溶剂优选是水，例如蒸馏水、重蒸馏水、去离子水、超纯水等。根据本发明的另一个实施方式中，本发明的化学发光组合物在使用的时候可以将其一部分组分负载在固体载体上，而将另外一部分组分(例如h2o2、基于碳酸盐的缓冲剂以及发光起始时间调节剂中的一种或多种)溶解或分散在溶剂中，所述溶剂优选是水，例如蒸馏水、重蒸馏水、去离子水、超纯水等。以所述化学发光组合物和溶剂(例如水)的总重量为100重量％计，所使用的溶剂(例如水)的量可以为80-99.8重量％，例如为82-99.5重量％，或者为85-99.2重量％，或者为88-99.1重量％，或者为90-99.0重量％，或者为92-98.9重量％，或者为95-98.5重量％，或者为98-98.1重量％。
[0069]
根据本发明的一个实施方式，所述化学发光组合物的各组分在使用前是各自分离的状态，在将要使用的时候相互混合，发生化学反应而发光。在本发明中，通过采用上述各种组分的组合，可以实现化学发光强度的显著提高，例如对于最优选的实施方式，当使用mn
2+
离子和基于碳酸盐的缓冲剂(实现约7.2左右的ph值)的情况下，最多可以使得cl发光强度相对于现有技术的cl体系实现四个数量级或更高的提高。与此同时，还可以实现非瞬态的化学发光，例如自化学发光起始时刻至化学发光完全停止的时刻，化学发光的持续时间
可以大于10秒，或者大于15秒，或者大于20秒，或者大于25秒，或者大于30秒，或者大于35秒，或者大于40秒，或者大于50秒，或者大于60秒，或者大于80秒，或者大于100秒，或者大于110秒，或者大于120秒，或者大于140秒，或者大于150秒，或者大于180秒，或者大于200秒，或者大于210秒，或者大于220秒，或者大于240秒，或者大于250秒，或者大于260秒，或者大于280秒，或者大于300秒，或者大于320秒，或者大于350秒，或者大于360秒，或者大于380秒，或者大于400秒，或者大于420秒，或者大于450秒，或者大于480秒，或者大于500秒，或者大于550秒，或者大于580秒，或者大于600秒，或者大于620秒，或者大于650秒，或者高达680秒，或者高达700秒，或者高达750秒，或者高达800秒，或者高达850秒，或者高达900秒，或者高达950秒，或者高达1000秒，或者高达1100秒，或者高达1200秒，或者高达1500秒。上述长持续时间的化学发光对于自动化cl系统来说是非常有利的。
[0070]
根据本发明的一个实施方式，还进一步向所述化学发光组合物中加入发光起始时间调节剂以实现调节发光起始时间的目的，所述发光起始时间调节剂选自：硫脲类化合物，c
4-c
16
糖醇，c
3-c
12
烷基单醇、二醇或三醇，含有一至四个羟基的c
6-c
16
芳族羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，砜类化合物，亚砜类化合物，哌啶类化合物，c
6-c
16
芳族胺类化合物，苯醌类化合物，超氧化物歧化酶(sod)，含有至少一个烯基的c
6-c
16
芳烃，苯硝酮类化合物，含有一至四个羟基以及至少一个烯基的c
6-c
16
羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，含有一至四个羟基以及至少一个烯基的c
6-c
16
环烷基羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，含有一至四个羟基的c
6-c
16
芳族羧酸、羧酸酐、羧酸酯或内酯，含有一至六个羟基的c
6-c
16
酚类化合物，含有一至六个羟基的c
6-c
16
芳族胺类化合物，氨基酸，肽，及其任意组合。根据本技术的一个更具体的实施方式，所述发光起始时间调节剂可以选自：硫脲、乙烯硫脲、氨基硫脲、2-甲基-3-氨基硫脲、甘露糖醇、叔丁醇、异丙醇、苯甲酸、二甲亚砜(dmso)、四甲基哌啶(tempo)、二苯胺、对苯醌、超氧化物歧化酶(sod)、1,1-二苯乙烯、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht)、叔丁基苯硝酮(pbn)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo)、抗坏血酸、异抗坏血酸、抗坏血酸磷酸盐、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸葡糖苷、没食子酸、焦性没食子酸、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻苯三酚、间苯三酚、均苯三酚、苯四酚、邻苯二胺、对苯二胺、间苯二胺、儿茶素、多巴胺、半胱氨酸、谷胱甘肽、及其任意组合；优选包括硫脲、乙烯硫脲、氨基硫脲、2-甲基-3-氨基硫脲、抗坏血酸、没食子酸、焦性没食子酸、邻苯二酚、对苯二酚、邻苯二胺、对苯二胺、儿茶素、半胱氨酸、谷胱甘肽及其任意组合。
[0071]
以所述化学发光组合物的总重量为基准计，所述发光起始时间调节剂的含量为0.01-6重量％，或者为0.02-5重量％，或者为0.04-4.5重量％，或者为0.05-4重量％，或者为0.08-3.5重量％，或者为0.1-3.2重量％，或者为0.2-3重量％，或者为0.3-2.5重量％，或者为0.4-2重量％，或者为0.5-1.5重量％，或者为0.6-1.0重量％。
[0072]
根据本发明的一个实施方式，基于所加入的发光起始时间调节剂的用量，可以对化学发光组合物的发光起始时间进行精确的定量调节。所述发光起始时间表示从将包括该调节剂在内的各组分混合而获得cl混合物的时刻起，至cl混合物开始发光的时刻之间的时间。例如，所述发光起始时间可以为1秒至1000秒，或者为5秒至900秒，或者为10秒至800秒，或者为20秒至700秒，或者为30秒至600秒，或者为40秒至550秒，或者为50秒至500秒，或者为60秒至450秒，或者为80秒至400秒，或者为100秒至350秒，或者为200秒至300秒，或者可以在以上任意两个端值构成的数值范围之内。
[0073]
根据本发明的另一个实施方式，建立了一种多种颜色的时间控制性发射体系，该方法包括使用本发明的化学发光组合物，并且在其中使用多种有机发光化合物，在这些有机发光化合物之间发生荧光共振能量转移(fret)，包括一步式荧光共振能量转移和多步式荧光共振能量转移，通过调节所述多种有机发光化合物的配比，可以实现多种颜色的cl图案。
[0074]
根据本发明的另一个实施方式，对于所述化学发光组合物负载在固体载体表面上的情况，所述固体载体包括氧化石墨烯、固体石蜡、分子筛、沸石、二氧化硅、玻璃等。根据本发明的另一个实施方式，在所述固体载体的表面上，以固体载体与所述化学发光组合物的总重量为基准计，所述化学发光组合物的负载量可以为0.1-15重量％，例如为0.2-13.2重量％，或者为0.5-12重量％，或者为0.8-10重量％，或者为1-9重量％，或者为2-8重量％，或者为3-7重量％，或者为4-6重量％，或者为4.5-5重量％。
[0075]
实施例
[0076]
为了更好地理解本发明，下面结合实施例以及附图对本发明进一步说明。以下实施例只用于对本发明进行进一步的阐明，不能理解为对本发明内容的限制，任何根据本发明的发明思路和技术方案做出一些非本质的改进和调整，都将涵盖在本发明的保护范围之内。
[0077]
若无特别说明，以下实施例中使用的试剂均为分析纯。
[0078]
在以下实施例中，如果记载了“按照与上述某实施例相同的步骤进行操作，区别仅在于
……”
，则表示采用随后记载的工艺条件和步骤，而其他没有提及的工艺条件和步骤按照引用的之前的实施例的记载。
[0079]
材料和试剂
[0080]
以下实施例中使用的有机发光体化合物l012购自和光化学工业公司(wako pure chemical industries)(日本大阪)，其直接溶于超纯水中以制备4mm的储存液。鲁米诺(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))和abei(tci，日本)分别溶于0.01m的naoh溶液以制备4mm的储存液。h2o2是每天用新鲜的30％(v/v)h2o2(新科电化学试剂厂，中国蚌埠)制备的，所有其他试剂购自国药集团(中国上海)，均为分析纯。超纯水用milli-q系统(密理博公司(millipore)，法国)制备并全程使用。
[0081]
co2/nahco3缓冲液的制备：在以下的各个实施例中，按照实施例中具体描述的浓度将碳酸氢钠溶解在超纯水中获得碳酸氢钠溶液，并在使用前向该溶液中通co2气体30分钟以上，以获得co2饱和的nahco3缓冲液。
[0082]
在以下的实施例中，采用以下的步骤来进行cl实验：使用lumistar omega微孔板cl分析仪测定cl动力学曲线，将所述l-012在超纯水中的储存液(直接使用或定量稀释以获得所需浓度)和金属硫酸盐在超纯水中的水溶液加入每个微孔中并混合均匀。然后在每个测试孔中加入50μl co2饱和的nahco3在超纯水中的溶液，并且任选地在每个微孔中添加发光起始时间调节剂，随后立即开始收集数据。采集背景信号2秒后，程序自动注入100μl h2o2。所有实验均在25℃下进行。
[0083]
cl照片由panasonic lumix dmcfz2000数码相机拍摄。
[0084]
cl光谱由自制的cl光谱采集系统测量，该系统由配备有液氮冷却pylon 400br-excelon数字电荷耦合装置(ccd)(普林斯顿仪器公司(princeton instruments)，美国)的
acton sp2300i单色仪组成。三维(3d)cl光谱由originlab绘制。
[0085]
实施例1
[0086]
在所述实施例1中，使用lumistar omega微孔板cl分析仪，向每个孔中添加25μl浓度为4mm的l012超纯水溶液和25μl不同浓度(0.04mm至8mm)的硫酸锰超纯水溶液，并将二者混合均匀，然后在每个测试孔中加入50μl co2饱和的浓度为1m的nahco3超纯水中的溶液，随后立即开始收集数据，采集背景信号2秒后，程序自动注入100μl浓度为0.5m的h2o2。所有组分全部加入完成之后，体系的ph值为7.2，整个实施例在25℃下进行。
[0087]
得到的cl发光强度-时间图显示在图1a和图1b中。图1a显示的cl曲线按照峰强度从低到高的顺序依次是使用mn浓度为5μm至100μm的硫酸锰溶液的实验，图1b显示的cl曲线按照峰强度从高到低的顺序依次是使用mn浓度为100μm至1000μm的硫酸锰溶液的实验。从图1a和1b可以看到，当mn浓度为100μm的时候，可以实现最高的cl发光强度，而当mn浓度为5μm的时候，cl发光持续时间最长。
[0088]
比较例1
[0089]
比较例1按照与实施例1相同的方式进行，区别仅限于该比较例中未添加硫酸锰水溶液，而是用相同体积的超纯水代替，其cl曲线如图2所示。从图2可以看到，在不使用金属离子的情况下，cl信号极低(相对强度值小于10)。
[0090]
比较例2
[0091]
比较例2按照与实施例1相同的方式进行，区别仅限于该比较例中未使用含有锰离子的水溶液，而是用相同体积相同浓度的硫酸铅(ii)、硫酸锌(ii)、硫酸镉(ii)、以及硫酸汞在超纯水中的水溶液替代，结果发现在使用上述四种金属盐的情况下，cl信号极低(相对强度值小于10)。
[0092]
比较例3
[0093]
比较例3按照与实施例1相同的方式进行，区别仅限于该比较例中未使用基于碳酸盐的缓冲剂水溶液，而是用相同体积和相同浓度的基于磷酸盐的缓冲剂水溶液代替，该磷酸盐水溶液同样用二氧化碳饱和，并且混合之后样品的ph值同样为7.2。其cl曲线如图3所示。从图3可以看到，虽然保持了相同的ph条件和饱和二氧化碳条件，但是该比较例3获得的cl信号极低(相对强度值小于10)。
[0094]
从以上实施例1与比较例1-3的比较可以看到，对于化学发光组合物处于水溶液中的情况，只有在将本发明具体限定的金属阳离子与基于碳酸盐的缓冲剂体系相组合才能够实现优异的cl强度和cl发光持续时间效果，而在省略掉金属阳离子，或者采用本发明保护范围以外的其他金属阳离子、或者使用其他缓冲剂体系的情况下，即使其他的工艺条件(例如其他组分浓度、用量、ph值等)保持不变的情况下也无法实现本发明实施例1那样优异的效果，比较例1-3的发光强度极低，几乎可以忽略不计。
[0095]
实施例2
[0096]
在该实施例2中重复实施例1的步骤合成了组合物水溶液，区别仅在于使用浓度为100μm的硫酸锰和硫酸钴(ii)溶液，水溶液样品在玻璃小瓶中进行配制，从样品开始发光的时刻开始，拍摄样品不同时刻的cl照片，结果列于图4a和4b，其中图4a显示使用硫酸锰制备的样品的照片，图4b显示使用硫酸钴制备的样品的照片。
[0097]
从图4a和图4b的照片可以看到，使用锰离子可以实现更高的发光强度，而使用钴
离子可以实现更长的cl发光持续时间。
[0098]
实施例3
[0099]
在该实施例中研究了用硫脲调节cl发光起始时间的效果。
[0100]
在所述实施例3中，使用lumistar omega微孔板cl分析仪，向每个孔中添加25μl浓度为4mm的l012超纯水溶液和25μl浓度为800μm的硫酸锰超纯水溶液，并将二者混合均匀，然后在每个测试孔中加入25μl co2饱和的浓度为1m的nahco3超纯水溶液，并且加入25μl不同浓度(0、0.1、0.2、0.5、1和2mg/ml)的硫脲在超纯水中的溶液，随后立即开始收集数据，采集背景信号2秒后，程序自动注入100μl浓度为0.5m的h2o2。所有组分全部加入完成之后，体系的ph值为7.2，整个实施例在25℃下进行。
[0101]
得到的三维(3d)cl光谱显示在图5a中。各实验实现的硫脲浓度与所得到的延迟时间的对数图如图5b所示。
[0102]
如以上的图5a所示，随着硫脲浓度的增加，发光起始时间的延迟也逐渐增加，在0到83秒的范围内。延迟时间(td/秒)的对数(log(td/秒))与硫脲浓度的对数(log(硫脲浓度/mg/ml))呈线性正相关，如图5b所示。其回归方程为td＝1.5230+0.5058
×
log c(mg/ml)，其相关系数为0.996。其中延迟的时间(td/秒)意为体系内存在或不存在硫脲时，cl强度达到100任意单位(a.u.)的时间之差。因此，可以用硫脲的浓度精确调控cl发射起始时间。同时，随着硫脲浓度增加，cl发射的峰值小幅增加，直到硫脲浓度达到0.2mg/ml，此时如果进一步增加硫脲浓度，峰值会下降。
[0103]
实施例4
[0104]
该实施例4使用八个并列的微孔，在每个微孔中添加与实施例3相同的原料，区别记载于使用不同浓度的硫脲超纯水溶液(浓度从0mg/ml至4mg/ml)，所有微孔中同时加入h2o2，拍摄这八个并列的微孔在不同时间的cl照片，结果显示在图6a和图6b中，这些图中显示了基于硫脲浓度调节使得不同样品的cl发光依次进行，由此体现出构建cl图案和cl编码的能力。
[0105]
实施例5
[0106]
该实施例5使用12微孔板(3
×
4)，依照实施例4所述的步骤，通过使用不同浓度的硫脲超纯水溶液准确地进行cl编码，其cl照片和对应的编码信息如图7所示，显示了大约2分钟内连续准确变化的cl照片和对应的编码。
[0107]
实施例6
[0108]
在该实施例中研究了用乙烯硫脲、氨基硫脲和2-甲基-3-氨基硫脲调节cl发光起始时间的效果。
[0109]
在所述实施例3中，使用lumistar omega微孔板cl分析仪，向每个孔中添加25μl浓度为4mm的l012超纯水溶液和25μl浓度为800μm的硫酸锰超纯水溶液，并将二者混合均匀，然后在每个测试孔中加入25μl co2饱和的浓度为1m的nahco3超纯水溶液，并且加入25μl不同浓度(0、0.1、0.5、1、2和2.5mg/ml)的硫脲在超纯水中的溶液，随后立即开始收集数据，采集背景信号2秒后，程序自动注入100μl浓度为0.5m的h2o2。所有组分全部加入完成之后，体系的ph值为7.2，整个实施例在25℃下进行。
[0110]
得到的三维(3d)cl光谱显示在图8a至图8c中，其中图8a对应于使用乙烯硫脲的实验，图8b对应于使用氨基硫脲的实验，图8c对应于使用2-甲基-3-氨基硫脲的实验。
[0111]
从这些图中可以看到，当使用上述调节剂的时候，也可以不同程度地实现cl发光起始时间的调节。
[0112]
实施例7
[0113]
在该实施例中研究了在使用鲁米诺和abei作为发光体有机化合物的情况下，硫脲对cl发光起始时间的调节作用。
[0114]
在所述实施例7中，使用lumistar omega微孔板cl分析仪，向每个孔中添加25μl浓度为4mm的鲁米诺或abei超纯水溶液和25μl不同浓度800μm的硫酸锰超纯水溶液，并将二者混合均匀，然后在每个测试孔中加入25μl co2饱和的浓度为1m的nahco3超纯水溶液，并且加入25μl不同浓度(0.5、1、2.5、5、10、15、17.5、20、25和30mg/ml)的硫脲在超纯水中的溶液，随后立即开始收集数据，采集背景信号2秒后，程序自动注入100μl浓度为0.5m的h2o2。整个实施例在25℃下进行。
[0115]
得到的三维(3d)cl光谱显示在图9a和图9b中，其中图9a对应于使用鲁米诺的实验，图9b对应于使用abei的实验。
[0116]
从这些图中可以看到，对于使用上述有机发光体化合物的情况，也可以用硫脲不同程度地实现cl发光起始时间的调节。
[0117]
实施例8
[0118]
在该实施例中研究了在使用多种不同的发光体有机化合物的情况下，通过荧光共振能量转移(fret)实现时间调节的多色cl。
[0119]
在该实施例8中，重复以上实施例3的步骤，区别在于，其中同时使用两种有机发光体(l012和罗丹明b(rhb)；或者l012和fl)或者使用三种有机发光体(l012、rhb和fl)。不希望局限于任何具体的理论，以上三种不同的配方建立了三种fret系统，即从l012(蓝色，发射波长约467nm)到罗丹明b(rhb)(红色，激发波长约550nm，发射波长约587nm)的一步法(图10a)，从l012到荧光素(fl)(绿色，激发波长约491nm，发射波长约523nm)(图10b)的一步法，和从l012经fl到rhb(图10c)的两步法。
[0120]
优化了l012、fl和rhb的配比后，确定fret最高效的配比为l012-rhb、l012-fl和l012-fl-rhb分别为26.6％、74.7％和55.0％。
[0121]
如图10d所示，通过调节fl或rhb的比例，可以通过混合波长发射产生更多的cl中间色。通过使用不同的fret系统，图7中的单色图案成功地转变为多色图案，如图11a所示。不同颜色的cl发射也可以同时控制(图11b、11c)。发射颜色和序列信息实际上是一个双层矩阵。如果我们在3
×
4孔板中使用两种颜色，没有时控性，则有2
12
＝4096种矩阵。如果将3
×
4孔板中的两种颜色分成两组按序列发射，则有(2
12
)
×
(2
12
)＝16,777,216种组合。本实验中，将6种颜色的cl分为4组按序列发射，计算可得约为3.6
×
10
16
种矩阵。因此，该系统具有位置、发射时间和颜色可调的特点，能够存储大量复杂的代码，并通过引发cl反应，以一序列的多色图案的形式简单地显示出来，可用于信号通信和加密技术。
[0122]
实施例9
[0123]
在该实施例中显示了负载在固体载体上的cl体系在硫脲作用下的化学发光起始时间调节作用。
[0124]
具体来说，将250μl聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)(4wt％,v/v)，40ml超纯水，200μl浓度为0.5m的naoh溶液和500μl浓度为6mm的haucl4溶液混合加热到100℃。在搅拌1h
后，移去热源，自然冷却至室温。接着向其中加入200μl浓度为4mm的l012，室温搅拌12h后，经10000rpm离心20min，将所得的下层纳米颗粒重新分散于2ml超纯水中，得到l012包裹的纳米金(gnps@l012)。向4ml浓度为0.5mg/ml的氧化石墨烯中加入1mm浓度为5mm的mn
2+
，混合搅拌30min，再加入1ml的上述制备的gnps@l012，并继续在室温下搅拌12h后，经13000rpm离心20min，将所得的下层颗粒重新分散于4ml超纯水中，得到同时固载l012和mn
2+
的氧化石墨烯(mn
2+
/go/gnps@l012)。
[0125]
使用lumistar omega微孔板cl分析仪，向每个孔中添加50μl mn
2+
/go/gnps@l012分散液，并将二者混合均匀，然后在每个测试孔中加入40μl co2饱和的浓度为1m的nahco3超纯水溶液，并且加入10μl不同浓度(0.001、0.01、0.02、0.04、0.1、0.4、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4mg/ml)的硫脲在超纯水中的溶液，随后立即开始收集数据，采集背景信号2秒后，程序自动注入100μl浓度为0.1m的h2o2。整个实施例在25℃下进行。获得的cl曲线如图12所示，可以看到对于固体负载的cl材料，也可以通过使用硫脲实现cl发光起始时间的精确调节。
[0126]
实施例10-15
[0127]
在实施例10-15中分别重复了以上所述实施例3的全部步骤，区别仅限于将实施例3的硫脲溶液替换成不同浓度(0、0.1、0.2、0.5、1和2mm)的以下所述的发光起始时间调节剂在超纯水中的溶液，这些实施例各自获得的三维(3d)cl光谱显示在图13a至图13f中，在这些图中，各种发光起始时间调节剂的浓度沿着箭头方向逐渐增大，分别为0、0.1、0.2、0.5、1和2mm。这些实施例各自具体使用的试剂种类以及显示其实验结果的附图汇总列于下表1。
[0128]
表1：实施例10-15所采用的发光起始时间调节剂种类以及显示其三维(3d)cl光谱的附图
[0129][0130]
从图13a至13f所示的3d cl光谱可以看到，这些试剂可以不同程度地实现延迟发光效果，其中多巴胺、没食子酸、焦性没食子酸和抗坏血酸随着加入浓度的调节，还能够同时实现提高发光强度的效果。
[0131]
实施例16-18
[0132]
在实施例16-18中分别重复了以上所述实施例3的全部步骤，区别仅限于将实施例3的硫脲溶液替换成不同浓度(0、0.1、0.2、0.5、1和2mm)的以下所述的发光起始时间调节剂在超纯水中的溶液，这些实施例各自获得的三维(3d)cl光谱显示在图14a至图14c中，在这些图中，各种发光起始时间调节剂的浓度沿着箭头方向逐渐增大，分别为0、0.1、0.2、0.5、1和2mm。这些实施例各自具体使用的试剂种类以及显示其实验结果的附图汇总列于下表2。
[0133]
表2：实施例16-18所采用的发光起始时间调节剂种类以及显示其三维(3d)cl光谱的附图
[0134] 实施例16实施例17实施例18发光起始时间调节剂儿茶素对苯二胺对苯二酚
显示其3d cl光谱的附图图14a图14b图14c
[0135]
从图14a至14c所示的3d cl光谱可以看到，这些试剂可以不同程度地实现延迟发光效果。
[0136]
实施例19-20
[0137]
在实施例19-20中分别重复了以上所述实施例3的全部步骤，区别仅限于将实施例3的硫脲溶液替换成不同浓度的半胱氨酸(0、2、4、8、40和50mm)及谷胱甘肽(0、1、5、10、20和40mm)以下所述的发光起始时间调节剂在超纯水中的溶液，这些实施例各自获得的三维(3d)cl光谱显示在图15a至图15b中，在这些图中，各种发光起始时间调节剂的浓度沿着箭头方向逐渐增大，分别为0、2、4、8、40、50mm(半胱氨酸，15a)及0、1、5、10、20、40mm(谷胱甘肽，15b)。这些实施例各自具体使用的试剂种类以及显示其实验结果的附图汇总列于下表3。
[0138]
表3：实施例19-20所采用的发光起始时间调节剂种类以及显示其三维(3d)cl光谱的附图
[0139] 实施例19实施例20发光起始时间调节剂半胱氨酸谷胱甘肽显示其3d cl光谱的附图图15a图15b
[0140]
从图15a至15b所示的3d cl光谱可以看到，这些试剂可以不同程度地实现延迟发光效果。可以看到半胱氨酸在40-50mm的浓度范围下可以实现很显著的发光起始时间调节效果，谷胱甘肽可以在2-8mm的浓度范围内同时实现一定程度的发光强度提高。