一种可循环快速检测孔雀石绿的荧光碳点的制备及应用

1.本发明涉及食品安全快速检测领域和纳米材料应用领域，具体涉及一种可循环快速检测孔雀石绿的荧光碳点的制备及应用。
技术背景
[0002][0003]
水产中违禁药物的残留是当前最严重的因素之一,孔雀石绿是其中最具代表性的一种。它是一种有毒的三苯甲烷类人工合成的具有金属光泽的绿色晶体，是有效杀灭霉菌的染料类药物，在水产养殖疾病防治中曾被广泛使用。但是它潜在致畸、致癌作用，有"苏丹红第二"之称，会严重危害人类健康。鉴于孔雀石绿对身体的毒副作用，我国于2020年1月发布的《中华人民共和国农业农村部公告中》明确将孔雀石绿列为食品动物中禁止使用的药品。国家质检总局、国家标准委也发布了gb/t19857-2005《鱼组织中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》的相关文件。
[0004]
目前检测孔雀石绿的方法有肉眼辨别，高效液相色谱法，色谱-质谱串联法以及酶联免疫方法等。这些方法存在明显的不足：肉眼检测，不够准确，缺乏依据；高效液相色谱法，色谱-质谱串联法和酶联免疫法，检测速度慢，检测成本高，需专业人员运用相关仪器进行专业操作来检测，影响了相关部门的执法力度和效率。而使用荧光法来检测孔雀石绿，操作简便，检测迅速，灵敏度高，具有良好的选择性，对于痕量检测范围宽，对检测物质可实现快速直观的定性定量分析。本发明合成的荧光碳点为红光碳点，将其命名为r-cds(red-carbon dots)， r-cds作为一种检测鱼组织中孔雀石绿的新型、稳定材料，不仅具有合成简单，水溶性好，选择性高，低毒性，灵敏度高等优势，还可在检测孔雀石绿的过程中被循环回收利用，节约资源，不对环境造成污染，实现了绿色化学所倡导的宗旨，应用前景广阔。


技术实现要素：

[0005]
本发明提出了一种可循环快速检测孔雀石绿的荧光碳点的制备及应用，所述荧光碳点(r-cds)在有孔雀石绿存在时荧光减弱，原位加入亚硫酸氢钠溶液后荧光恢复，采用该方法检测孔雀石绿的含量，操作简单，快速灵敏，r-cds可循环重复利用，成本低效率高，安全环保。
[0006]
实现本发明的技术方案是：
[0007]
一种可循环快速检测孔雀石绿的荧光碳点的制备方法，步骤如下：
[0008]
s1.将久洛利定、无水柠檬酸和8-羟基久洛利定溶于乙醇中，采用微波合成法，加热至160℃，反应2h，冷却至室温，得到粗产品；
[0009]
s2.将步骤s1中制得的粗产品通过硅胶色谱柱以二氯甲烷和无水乙醇组成的洗脱剂进行分离纯化；
[0010]
s3.将经步骤s2纯化后的碳点溶液通过旋转蒸发，得到固体碳点，称为 r-cds。
[0011]
所述步骤s1中久洛利定、无水柠檬酸和8-羟基久洛利定的物质的量比为 1:2:1，
优选地，所述久洛利定和8-羟基久洛利定溶于乙醇中的浓度为0.025mol/l，所述无水柠檬酸溶于乙醇中的浓度为0.05mol/l。
[0012]
所述步骤s2中二氯甲烷和无水乙醇的体积比为10:1。
[0013]
一种可循环快速检测孔雀石绿的荧光碳点的应用。
[0014]
上述应用具体包括：
[0015]
1)溶液配制：配制ph为7.4，终浓度为100mm的pbs溶液，以水为溶剂配制浓度为10mm的孔雀石绿溶液和浓度为10mm的亚硫酸氢钠溶液，将固体 r-cds溶于有机溶剂中得到碳点储备液，优选地，所述有机溶剂为dmso，所述碳点储备液的浓度为10mg/ml；
[0016]
2)在pbs溶液中，加入一定量的碳点储备液，再依次加入孔雀石绿溶液和亚硫酸氢钠溶液，使得r-cds的终浓度为15μg/ml，孔雀石绿的终浓度为15μm，亚硫酸氢钠的终浓度为100μm，以530nm光激发，测定加入孔雀石绿溶液前后混合溶液在595nm处的荧光强度变化和加入亚硫酸氢钠溶液后混合溶液在 595nm处的荧光强度变化；观察混合溶液的荧光随时间变化的关系；在365nm 紫外灯照射下观察溶液的颜色变化；
[0017]
3)在pbs溶液中，加入碳点储备液，再分别加入不同量的孔雀石绿溶液，使得r-cds的终浓度为15μg/ml，孔雀石绿的终浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、 5、10、15、20和25μm，以530nm光激发，使用荧光分光光度计测定加入不同量孔雀石绿溶液后的荧光光谱，观察溶液在595nm处的荧光强度随孔雀石绿浓度的变化关系，并在日光下观察溶液的颜色变化；
[0018]
4)在pbs溶液中，加入碳点储备液和孔雀石绿溶液，再分别加入不同量的亚硫酸氢钠溶液，使得r-cds的终浓度为15μg/ml，孔雀石绿的终浓度为15μm，亚硫酸氢钠的终浓度分别为5、10、15、20、30、40、50、100、150、200和250μm，以530nm光激发，使用荧光分光光度计测定加入不同量亚硫酸氢钠溶液后的荧光光谱，并在日光下观察溶液的颜色变化。
[0019]
荧光光谱的变化为：以530nm光激发时，步骤2)中加入孔雀石绿溶液后，溶液的荧光光谱在595nm处的荧光强度明显下降，说明了孔雀石绿可有效猝灭 r-cds的荧光；原位加入亚硫酸氢钠溶液后，溶液在595nm处的荧光明显增强，说明了亚硫酸氢钠可使r-cds荧光恢复；步骤3)中溶液在595nm处的荧光强度随着孔雀石绿浓度的增加而降低，说明可通过荧光值变化对孔雀石绿进行定量检测；步骤4)中加入不同量的亚硫酸氢钠溶液时，随着亚硫酸氢钠浓度在5-100μm 范围内不断增大，混合溶液的荧光强度也在增大，但当亚硫酸氢钠的浓度大于/ 等于100μm时，r-cds的荧光恢复强度达到最大。
[0020]
溶液的荧光随时间变化的关系为：步骤2)中加入孔雀石绿溶液后，r-cds 的荧光在1s内猝灭了50％左右，说明r-cds可灵敏检测孔雀石绿；继续向混合液中加入亚硫酸氢钠溶液后，r-cds的荧光在50s内基本恢复。
[0021]
在365nm紫外灯照射下溶液颜色变化为：步骤2)加入孔雀石绿溶液后，溶液颜色由粉红色变为无色，原位加入亚硫酸氢钠溶液后，溶液颜色由无色变为浅粉红色。
[0022]
在日光下溶液的颜色变化为：步骤3)中随着孔雀石绿浓度由0.5μm增大至25μm，在日光下溶液颜色由粉红色变为蓝绿色；步骤4)中随着亚硫酸氢钠的浓度由5μm增加至250μm，在日光下溶液由蓝绿色变为浅粉红色；
[0023]
检测鱼组织中孔雀石绿的含量，包括如下步骤：
[0024]
(1)绘制标准工作曲线：在不同体积的pbs溶液中加入一定量的碳点储备液，再分别加入不同量的孔雀石绿溶液，使得r-cds的终浓度为15μg/ml，孔雀石绿的终浓度分别为
0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、15、20和25μm，以530nm 光激发，使用荧光分光光度计测量每种溶液在595nm处的荧光强度，记录荧光发射光谱，获得荧光猝灭效率(δf/f0)随孔雀石绿浓度的变化关系，绘制标准工作曲线，其中δf＝f
0-f，f0表示没有加入孔雀石绿溶液时的荧光发射强度，f表示加入不同量孔雀石绿溶液后的荧光发射强度；
[0025]
(2)测定干扰物的影响：在pbs溶液中加入一定量的碳点储备液，再分别加入一定量的孔雀石绿溶液和与孔雀石绿终浓度相同的鱼组织中可能存在的干扰物，r-cds的终浓度为15μg/ml，孔雀石绿的终浓度为15μm，所述干扰物包括：金属离子(na
+
、k
+
、al
3+
、fe
3+
、cu
2+
、fe
2+
、ca
2+
和mg
2+
)、半胱氨酸(cys)、谷氨酸(glu)、苏丹红(sudanⅲ)、亚甲基蓝(mbt)、灿烂绿(bg) 以及胭脂红(carmine)，相互作用后通过荧光光谱检测每种混合溶液在595nm 处的荧光猝灭情况；
[0026]
(3)检测实际鱼组织样品中孔雀石绿含量：制备鱼组织提取液，加入到 pbs溶液与碳点储备液的混合溶液(r-cds溶液)中，通过荧光分光光度计检测 595nm处的荧光强度，根据步骤(1)获得的标准工作曲线计算鱼组织中孔雀石绿的含量；
[0027]
(4)采用亚硫酸氢钠溶液处理，使r-cds荧光恢复并循环利用。
[0028]
本发明的有益效果是：(1)本发明合成方法快速简单，加热均匀，节约能源； (2)本发明可灵敏精准检测孔雀石绿，且可以通过荧光值的变化对孔雀石绿进行定量检测；(3)本发明可以实现对食用鱼中孔雀石绿含量的检测，具有极高的实用性；(4)本发明可实现循环检测孔雀石绿以及荧光碳点的重复利用。
附图说明
[0029]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]
图1为r-cds的合成步骤图；
[0031]
图2为r-cds的tem图，xps图和ft-ir图谱；
[0032]
图3为不同溶液处于595nm处的荧光发射光谱图，激发波长为530nm，插图为365nm紫外灯照射下相应溶液的荧光照片；其中：
①
表示15μg/ml的r-cds 溶液(r-cds溶液为碳点储备液与pbs溶液的混合液)，
②
表示孔雀石绿溶液与 pbs溶液的混合液(孔雀石绿终浓度为15μm)，
③
表示r-cds溶液和孔雀石绿溶液的混合溶液(r-cds终浓度为15μg/ml，孔雀石绿终浓度为15μm)，
④
表示 r-cds溶液、孔雀石绿溶液和亚硫酸氢钠溶液的混合溶液(r-cds终浓度为 15μg/ml，孔雀石绿终浓度为15μm，亚硫酸氢钠溶液终浓度为100μm)；
[0033]
图4为在pbs溶液(100mm，ph＝7.4)中，加入1.5μl碳点储备液和不同量孔雀石绿溶液(孔雀石绿终浓度0-25μm，终体积1ml)后荧光变化图，及孔雀石绿浓度在2.5-25μm变化范围内与荧光猝灭效率的标准工作曲线图；
[0034]
图5为r-cds溶液分别与孔雀石绿及与孔雀石绿等浓度的干扰物作用后在 595nm处的荧光猝灭效率柱状图；
[0035]
图6为在pbs溶液(100mm，ph＝7.4)中，加入1.5μl碳点储备液、1.5μl 孔雀石绿溶液和不同量亚硫酸氢钠溶液(亚硫酸氢钠终浓度0-250μm，终体积均为1ml)后荧光变化图；
[0036]
图7为在987μl的pbs溶液中加入1.5μl碳点储备液，再依次加入1.5μl 孔雀石绿溶液和10μl亚硫酸氢钠溶液后，荧光猝灭和荧光恢复的时间扫描荧光光谱图。
[0037]
图8为r-cds溶液在孔雀石绿和亚硫酸氢钠的5次重复处理下，在595nm 处的荧光强度变化图。
具体实施方式
[0038]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039]
实施例1
[0040]
一种可循环快速检测孔雀石绿的荧光碳点的制备方法，包括以下步骤：分别称量69.3mg的久洛利定，153.6mg的无水柠檬酸和75.7mg的8-羟基久洛利定 (物质的量比为1:2:1)溶于16ml的乙醇(分析纯)中于微波合成管中，将微波合成管置于微波合成仪中，加热至160℃，反应2h，冷却至室温后，得到粗产品；将粗产品通过硅胶色谱柱以二氯甲烷和无水乙醇(体积比为10:1)组成的洗脱剂进行分离纯化；纯化后的碳点溶液通过旋转蒸发，得到固体碳点r-cds。
[0041]
如图2所示，透射电子显微镜、x射线光电子能谱和傅立叶变换红外光谱均表示荧光碳点r-cds的成功制备。
[0042]
透射电子显微镜结果表示该碳点为近似球形的结构，平均粒径为2.5nm；
[0043]
x射线光电子能谱结果表示284.8ev，399.8ev，和537.8ev，分别对应于c 1s，n 1s和o1s，它们的相对含量(质量百分数)分别为85.28％，8.3％，和 6.42％；
[0044]
傅立叶变换红外光谱中得到的结果为：-oh的伸缩振动在3440cm-1
，c-h的反对称伸缩振动在2925cm-1
，对称伸缩振动在2856cm-1
，c＝o的伸缩振动在1735 cm-1
，c＝o的苯环骨架振动在1630cm-1
，c-n的伸缩振动在1180cm-1
，c-o的伸缩振动在1081cm-1
，c-h的伸缩振动在474cm-1
。
[0045]
实施例2
[0046]
r-cds在循环检测孔雀石绿中的应用，包括以下步骤：
[0047]
1)溶液配制
[0048]
首先依次配制ph为7.4，终浓度为100mm的pbs溶液，浓度为10mm的孔雀石绿溶液以及10mm的亚硫酸氢钠溶液，将实施例1中制备的固体r-cds 溶于dmso中配制浓度为10mg/ml的碳点储备液；
[0049]
2)在987μl的pbs溶液中加入1.5μl的碳点储备液，再依次加入1.5μl的孔雀石绿溶液以及10μl的亚硫酸氢钠溶液，终体积保持1ml。用荧光分光光度计检测加入孔雀石绿前后的荧光强度以及加入亚硫酸氢钠后的荧光强度，激发波长为530nm；并通过365nm的紫外灯观察其荧光颜色变化，拍照记录。
[0050]
图3表明：
①
r-cds溶液本身具有较高的荧光强度；
②
孔雀石绿本身无荧光；
③
r-cds溶液加入孔雀石绿溶液后的荧光值降低，说明r-cds可用于检测溶液中是否存在孔雀石绿；
④
原位加入亚硫酸氢钠溶液后r-cds溶液的荧光值基本恢复，说明r-cds可循环重复利
用；在365nm紫外灯照射下，观察到：在r-cds 溶液中加入孔雀石绿溶液后，溶液颜色由粉红色变为无色，原位加入亚硫酸氢钠溶液后，溶液颜色由无色变为浅粉红色。
[0051]
实施例3
[0052]
采用r-cds检测鱼组织中孔雀石绿的含量，包括以下步骤：
[0053]
(1)探究荧光猝灭效率与孔雀石绿浓度的关系，绘制标准工作曲线
[0054]
在不同体积的pbs溶液中加入1.5μl的碳点储备液，再分别加入不同量的孔雀石绿溶液，使其终浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、15、20和25μm，终体积均保持1ml，使用荧光分光光度计测量各溶液的荧光强度，记录荧光发射光谱，激发波长为530nm。
[0055]
图4表明，随着孔雀石绿溶液浓度的不断增大，溶液的荧光强度随之下降，且当孔雀石绿的浓度在2.5-25μm之间时呈现良好的线性关系，线性方程为δf/f0＝0.0147[mg]+0.3668(r2＝0.999)，检测限为12.9nm，其中δf＝f
0-f，f0表示没有加入孔雀石绿溶液时的荧光发射强度，f表示加入不同量孔雀石绿溶液后的荧光发射强度，[mg]表示孔雀石绿的浓度；这说明本发明碳点对孔雀石绿的检测具有较高的灵敏度。
[0056]
(2)探究r-cds对孔雀石绿的选择性，确定干扰物对结果的影响
[0057]
在的pbs溶液中加入1.5μl的碳点储备液，再分别加入1.5μl孔雀石绿溶液和与孔雀石绿终浓度相等的鱼组织中可能存在的干扰物质，终体积保持1ml，干扰物包括：金属离子(na
+
、k
+
、al
3+
、fe
3+
、cu
2+
、fe
2+
、ca
2+
和mg
2+
)、半胱氨酸(cys)、谷氨酸(glu)、苏丹红(sudanⅲ)、亚甲基蓝(mbt)、灿烂绿(bg) 以及胭脂红(carmine)，相互作用后通过荧光发射光谱检测每种混合溶液在595 nm处的荧光猝灭情况，激发波长为530nm。
[0058]
图5表明，所测干扰物质对r-cds的荧光几乎没有影响，只有在加入孔雀石绿后，r-cds的荧光明显被猝灭，说明r-cds对孔雀石绿具有较高的特异性识别。
[0059]
(3)检测实际鱼组织样品中孔雀石绿的含量
[0060]
提取液的制备：分别将1g鲈鱼组织和1g鲫鱼组织彻底破碎后于离心管中，加入5ml乙腈溶液，超声5分钟后，12000rpm离心5min，取上清液备用。
[0061]
采用标准加入法，在15μg/ml的r-cds溶液中，加入5μl待测样本提取液，测定体系在595nm处的荧光强度，激发波长为530nm，根据标准工作曲线计算鱼组织样本中孔雀石绿的含量，检测结果见表1；在上述加入待测样本提取液的体系中分别加入不同标准加入量的孔雀石绿溶液(终浓度分别为5，7和9μm)，终体积均保持1ml，测定体系在595nm处的荧光强度，根据标准工作曲线获得孔雀石绿的总测出量，求得回收率和相对标准偏差，检测结果见表1。
[0062]
表1鲫鱼和鲈鱼中孔雀石绿含量检测结果、回收率和相对标准偏差
[0063][0064]
(4)荧光恢复及循环利用
[0065]
a.荧光恢复效率探究：
[0066]
在不同体积的pbs溶液中，加入1.5μl的碳点储备液和1.5μl的孔雀石绿溶液，然后分别加入0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20和25μl的亚硫酸氢钠溶液，终体积均保持1ml，使用荧光分光光度计测量各溶液的荧光强度，记录荧光发射光谱，激发波长为530nm。
[0067]
图6表明，随着亚硫酸氢钠浓度的在5-100μm范围内不断增大，混合溶液的荧光强度也在增大，但当亚硫酸氢钠的浓度大于/等于100μm时，r-cds的荧光恢复强度达到最大，说明亚硫酸氢钠与孔雀石绿反应达到一个平衡状态。
[0068]
b.荧光碳点r-cds对孔雀石绿的响应速度以及荧光恢复速率的探究：
[0069]
在987μl的pbs溶液中加入1.5μl的碳点储备液，再依次加入1.5μl的孔雀石绿溶液以及10μl的亚硫酸氢钠溶液，终体积保持1ml，用荧光分光光度计检测溶液在595nm处其荧光强度随时间变化的关系，激发波长为530nm。
[0070]
图7表明，在的r-cds溶液中先加入孔雀石绿溶液后，r-cds的荧光在1s 内猝灭了50％左右，说明了r-cds可灵敏检测孔雀石绿；而继续向混合溶液中加入亚硫酸氢钠溶液后，r-cds的荧光在50s内基本恢复。
[0071]
c.循环检测孔雀石绿的探究：
[0072]
①
在1ml的pbs溶液中加入1.5μl的碳点储备液；
②
再依次加入1.5μl的孔雀石绿溶液和10μl的亚硫酸氢钠溶液；
③
重复步骤
②
五次；用荧光分光光度计检测在595nm处溶液荧光强度随时间变化的关系，激发波长为530nm。
[0073]
图8表明，先后五次加入孔雀石绿溶液和亚硫酸氢钠溶液的过程中，r-cds 的荧光可五次猝灭与恢复，说明r-cds能够循环用于检测鱼组织中的孔雀石绿。
[0074]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。