一种环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针及其制备方法和应用

1.本发明涉及固相微萃取技术领域，尤其是涉及一种环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.固相微萃取(solid-phase microextraction，spme)是由加拿大滑铁卢大学janusz pawliszyn于上世纪九十年代初发明的新型样品前处理技术，曾被誉为九十年代最伟大的发明之一。与传统固相萃取技术相比，spme具备操作简便，易于实现实地采样分析等优势。此外，高效率、低检出限等优势，也使得其成为目前所采用的样品前处理技术中应用最为广泛的技术之一。
3.固相微萃取原理是基于分析物在萃取涂层与样品溶液间的分配比例，使得分析物能够进入萃取涂层从而达到富集分离的目的。因而，萃取涂层是决定spme技术萃取效率的关键因素。由于生物样品大部分为水相，生物代谢物也多为极性或者高极性物质，如何从高极性水相中提前极性分析物，也是固相微萃取技术面临的一个挑战。目前商业化生产的spme探针大多适合对非极性或者弱极性分析物进行富集，在适合极性分析物富集的spme探针的开发上存在极大空缺。
4.因此，很有必要提供一种生物相容性良好，对极性分析物有较高吸附效率的spme探针材料。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针及其制备方法和应用。本发明使用环糊精多孔聚合物材料作为固相微萃取探针表面涂层的吸附剂，该材料利用共价框架结构的多孔性及环糊精与嘌呤的包合作用，提高材料对嘌呤的吸附效率。该探针可应用于复杂样品中嘌呤的分析检测。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.第一方面，本发明提供了一种环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针，包括钢丝和钢丝上的表面涂层，所述表面涂层为环糊精多孔聚合物材料；所述环糊精多孔聚合物材料包括质量比为(5-5.2):1.0的七氨基-β环糊精和对苯二甲醛。
8.固相微萃取技术的核心在于萃取探针上的萃取涂层，本发明使用环糊精多孔聚合物材料作为固相微萃取探针表面涂层的吸附剂，该材料结合聚合物材料的多孔、高比表面积的优势性能和环糊精对嘌呤的有效包合作用，在高极性的水相基质下，对嘌呤的萃取性能仍保持高灵敏度和高富集性能，可应用于对水相生物样品中嘌呤的检测富集。而普通的环糊精接触水会形成水合物，难以直接作为吸附剂对水样进行萃取。
9.作为本发明所述环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针的优选实施方式，所述环糊精多孔聚合物材料通过常温合成，具体制备方法包括以下步骤：
10.以乙醇和水作为溶剂，以七氨基-β环糊精和对苯二甲醛作为反应单体，加入浓氨水作为催化剂，合成聚合物材料，将聚合物材料和甲醇混合震荡，离心收集产物，获得环糊精多孔聚合物材料；其中，对苯二甲醛和浓氨水的质量比为1.0:(22-23)。
11.所述环糊精多孔聚合物材料的平均孔径为2～2.5nm，比表面积为300～350m2/g。具体地，比表面积为318.9m2/g，孔径为2.18nm，高比表面积促使环糊精多孔聚合物材料能充分与样品溶液接触，对分析物的萃取有一定促进作用。
12.优选地，环糊精多孔聚合物材料制备过程中，乙醇和水的体积比为1:1。
13.所述环糊精多孔聚合物材料制备过程中，反应温度为室温，反应时间为48h。
14.作为本发明所述环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针的优选实施方式，所述环糊精多孔聚合物材料的制备方法中，反应初始七氨基-β环糊精的浓度为(2.23-2.33)g/l；反应初始加入催化剂浓氨水浓度为147mmol/l。优选地，浓氨水的质量分数为25％wt。
15.作为本发明所述环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针的优选实施方式，所述表面涂层的厚度为5-50μm，长度为1-2cm。
16.第二目的，本发明提供了上述环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针的制备方法，包括以下步骤：
17.s1、以乙醇和水作为溶剂，以七氨基-β环糊精和对苯二甲醛作为反应单体，加入浓氨水作为催化剂，合成聚合物材料；
18.s2、将聚合物材料和甲醇混合震荡，离心收集产物，获得环糊精多孔聚合物材料；
19.s3、将环糊精多孔聚合物材料和聚合物溶液混合，得到混合溶液，将钢丝伸入混合溶液中，浸渍提拉，干燥，制得环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针。
20.优选地，钢丝的直径为480μm，钢丝长度为3～4cm，浸渍提拉的次数为1～4次。
21.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，七氨基-β环糊精、对苯二甲醛和浓氨水的质量比为(5-5.2):1.0:(22-23)。
22.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤s2中，所述聚合物材料和甲醇质量比为1:(50-100)，优选地，质量比为1:100。
23.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述聚合物溶液为聚丙烯腈/n,n-二甲基甲酰胺溶液，所述聚丙烯腈/n,n-二甲基甲酰胺溶液中聚丙烯腈的质量占比为5～12％，优选地，所述聚丙烯腈/n,n-二甲基甲酰胺溶液中聚丙烯腈的质量占比为10％。
24.聚合物溶液的浓度影响后续材料在溶液中的分散均匀度，且会影响探针的形貌。聚合物溶液过稀，进行提拉实验时，负载在钢丝上的涂层厚度过薄，且极易导致挂珠，涂层形貌凹凸不平；溶液浓度过高，一次提拉的涂层厚度过厚，且材料在聚合物溶液中分散困难，极易导致材料团聚，影响探针重现性及性能。因而，基于大量研究实验发现，当聚丙烯腈/n,n-二甲基甲酰胺溶液中聚丙烯腈的质量占比为5～12％时，环糊精多孔聚合物材料与聚合物溶液混合，可以尽可能将负载材料最大化，发挥材料性能最大化，环糊精多孔聚合物材料与聚合物溶液质量比可控制在1:(5-50)。当聚丙烯腈/n,n-二甲基甲酰胺溶液中聚丙烯腈的质量占比为10％时，获得的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针性能最佳。
25.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述环糊精多孔聚合物材料与聚合物溶液质量比为1:(5-50)，更优选地，所述环糊精多孔聚合物材料与聚合物溶液质量比为1:10。
26.所述环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针制备过程中，反应温度为室温，反应时间为48h。
27.本发明的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针每次使用前需在甲醇中净化5-10min。
28.第三目的，本发明提供了上述环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针在富集检测生物样品中嘌呤的应用。
29.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
30.本发明环糊精多孔聚合物材料的制备操作简便，所获得的ncp在保留ncp材料的高比表面积、多孔性等优势下，引入环糊精单体，环糊精与嘌呤的有效包合作用，增强了材料对嘌呤的吸附性能，从而提高对嘌呤的吸附效率。本发明提供的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针具备对嘌呤萃取性能优异，富集性能强，灵敏度低等优点。本发明提供的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针能够有效地检测生物样品中的嘌呤。
附图说明
31.图1为实施例1中的环糊精多孔聚合物材料的等温吸脱附曲线图；
32.图2为实施例1中的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针用扫描电镜表征的探针微观形貌图i；
33.图3为实施例1中的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针用扫描电镜表征的探针微观形貌图ii；
34.图4为实施例1中的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针的抗蛋白沉积maldi图；
35.图5为实施例1中的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针与商品化探针(pdms、pa、pdms/dvb)对6种嘌呤的萃取性能对比图。
具体实施方式
36.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
37.在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
38.实施例1、一种环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针及其制备方法
39.环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针的制备方法，包括以下步骤：
40.1)环糊精多孔聚合物材料的制备：
41.称取68.6mg七氨基-β环糊精和13.4mg对苯二甲醛于50ml烧杯中，向烧杯中加入30ml乙醇水混合溶剂(1：1，v：v)，超声30min使体系均匀分散后，加入300μl浓氨水(25％wt)作为催化剂，反应48h后，将混合物离心，随后用乙醇和水依次洗涤三次，将得到的ncp材料分散于50ml甲醇中，震荡48小时以除去孔洞中的未反应物质。后将材料置于真空干燥箱中干燥。记为β-cd-ncp。
42.2)环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针的制备：
43.(1)将不锈钢纤维截成4cm长度后，按顺序依次在超纯水、甲醇中浸泡、在室温下超
声15min，取出后自然晾干，备用。
44.(2)将15.6mg聚丙烯腈与140mg n,n-二甲基甲酰胺混合搅匀后，超声15min，得到均匀溶解的聚丙烯腈/n,n-二甲基甲酰溶液。
45.(3)称取15.6mg制备的β-cd-ncp材料，加入(2)体系均匀搅拌，超声15min使其均匀分散。
46.(4)将步骤(1)预处理过的不锈钢纤维前端1cm伸入(3)中得到的均匀体系中，缓慢向上提拉，得到表面均匀的β-cd-ncp/聚丙烯腈混合涂层。
47.(5)将纤维放置在80℃烘箱中烘干1小时。取出，重复操作至涂层厚度达到要求。该表面涂层的长度为1cm，厚度为5～50μm得到的纤维在甲醇中浸泡过夜以除去涂层中含有的杂质，取出备用，制得环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针。
48.参考图1为β-cd-ncp材料的吸脱附曲线图，实验测试结果显示，制备的β-cd-ncp材料平均孔径为2～2.5nm，比表面积为300～350m2/g。具体地，比表面积为318.9m2/g,孔径为2.18nm。高比表面积促使材料能充分与样品溶液接触，对分析物的萃取有一定促进作用。
49.环糊精空腔为0.8nm，ncp材料平均孔径约2.18nm，本工作选择的六种嘌呤分子大小低于0.9nm，因而嘌呤能进入制备的ncp材料孔中，达到吸附效果。结合环糊精对嘌呤的包合作用等优势所制备的材料能对目标分析物嘌呤进行高效吸附。
50.从图2和图3中可观察到所制得的β-cd-ncp固相微萃取探针用扫描电镜表征的探针微观形貌图。
51.实施例2、环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针对蛋白质的的抗沉积效果
52.探究本发明实施例1制得的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针对蛋白质的抗沉积效果。
53.将本发明实施例1制得的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针在用pbs溶液稀释十倍后的血清样本中进行萃取。再将萃取完毕的探针用流动的超纯水冲洗10s除去探针上的萃取相，用无尘纸轻轻擦干后，将探针浸没在80微升脱附溶剂中脱附。得到的脱附液经由基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(maldi-tof ms)进行分析，所加基质为10mg/ml dhb(30％乙腈，0.1％三氟乙酸)，比较m/z在1000-10000间基质和脱附液的质谱图分析，结果如图4所示，脱附液在m/z》1000时无明显出峰，说明所制备探针有着良好的抗蛋白沉积效果。
54.实施例3、环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针在萃取分析嘌呤的应用
55.测定本发明实施例1制得的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针与商业化pdms萃取探针(sulpelco公司)、pa萃取探针(sulpelco公司)及pdms/dvb萃取探针(sulpelco公司)对6种嘌呤的萃取能力。
56.将本发明实施例1制得的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针与商业化pdms萃取探针、pa萃取探针和pdms/dvb萃取探针分别在6种嘌呤(xanthosine、hypoxanthine、xanthine、guanosine、guanine、adenine)浓度均为100ppb的缓冲溶液中萃取30min后，将萃取完毕的探针在流动的超纯水冲洗10秒后，将探针置于80微升脱附液中脱附30min后取出，脱附液进入hplc-ms/ms仪器中分析，比较各物质的峰面积，从而比较不同探针对不同分析物的吸附能力，结果如图5所示。
57.实验结果表明本发明制得的环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针对所测6种嘌
呤的吸附性能均高于商业化萃取探针，说明环糊精多孔聚合物材料固相微萃取探针对嘌呤有着良好的萃取性能。
58.综上所述，本发明使用制备的环糊精多孔聚合物材料(β-cd-ncp)作为固相微萃取探针表面涂层的吸附剂，该材料结合聚合物化合物材料的多孔性和环糊精与嘌呤的有效包合作用，在高极性水相样品中，可有效捕获嘌呤分子，提高材料对嘌呤的吸附效率，可应用于对复杂生物样品中嘌呤的检测富集。
59.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。