一种通用型肽检测荧光探针及其制备与应用的制作方法

本发明属于生物荧光分析领域，具体涉及一种用于识别肽类的荧光探针及其制备与应用。该荧光探针是一种具有荧光特性的共价有机多孔框架纳米片，利用该荧光探针与疏水肽分子间的亲-疏水相互作用导致其发光强度的变化，实现溶液中疏水多肽的高灵敏定量分析，也可通过酶解产物中疏水肽的相对定量，实现亲水肽或蛋白质的定量分析。本发明在肽类药物和诊断标志物的快速检测方面具有潜在应用前景。

背景技术：

1、生物活性肽广泛存在于生物体中，参与许多重要的生理活动和病理过程，包括细胞分化、神经递质调节和肿瘤疾病的发生，并经常作为临床治疗药物和疾病诊断分子。内源性肽生物标志物和外源性肽药物在高度复杂的生物环境中几乎都是低丰度的，因此需要高灵敏、快速的肽检测技术。基于荧光的分析方法灵敏度高，但大多需要荧光标记、化学衍生等破坏性前处理过程，会改变目标肽的分子结构，与后续表征技术不兼容。因此，仍缺乏无损、通用的肽荧光检测方法。

2、共价有机框架(cofs)是一类完全由强共价键构建的晶体多孔材料。聚集诱导发光(aie)与平面延伸的π-π共轭骨架的结合赋予了部分cofs优异的发光活性。近年来，基于荧光cofs对目标分子的发光响应的检测平台开始蓬勃发展，已应用于定量分析重金属离子、ph、小分子疾病标志物、活性氧和抗生素的检测，具有灵敏度高、快速便捷等特点。尚未有报道利用肽和荧光cofs材料之间直接相互作用实现肽的荧光传感。

技术实现思路

1、针对现有技术的以上缺陷和需求，本发明旨在提供一种肽定量检测荧光探针及其制备与应用。

2、本发明通过自上而下的策略制备含聚集诱导发光(aie)基团的cons，并将其均匀分散在溶液中，得到开关型荧光探针。本发明中的荧光cons探针可用于溶液中疏水性肽的快速定量分析，也可通过酶解产物中疏水肽的相对定量，实现亲水肽或蛋白质的定量分析。该发明对肽的快速和灵敏定量检测具有普遍适用性。

3、为实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种荧光探针。

4、本发明所提供的荧光探针为：以具有荧光特性的体相共价有机多孔框架(cofs)为原料，通过自上而下策略制备的共价有机多孔框架纳米片(cons)；

5、其中，所述具有荧光特性的体相共价有机多孔框架(cofs)为以氰基取代二苯乙烯结构作为有机构建模块连接基团的体相共价有机多孔框架(cofs)。

6、具体地，所述共价有机多孔框架纳米片cons还含有2，4，6-三苯基-1，3，5-三嗪结构单元，结构如下图所示：

7、

8、其中，n＝1，2或3。

9、更具体地，所述共价有机多孔框架纳米片(cons)含有如下所示的结构单元：

10、

11、本发明的另一方面，提供了上述荧光探针的制备方法。

12、本发明所提供的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：对具有荧光特性的体相共价有机多孔框架(cofs)进行自上而下处理，将cons从产物中分离，干燥，即得。

13、所述具有荧光特性的cofs原料的荧光特性源于构建cofs的有机模块间键合所形成的聚集诱导荧光发色团，具体为氰基取代二苯乙烯结构。

14、所述自上而下处理的方法为液相剥离法，具体指溶剂辅助超声剥离法。

15、所述自上而下处理的操作为：将具有荧光特性的体相共价有机多孔框架(cofs)分散到溶剂中，超声处理，即可，

16、其中，所述溶剂为水以及甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇等有机溶剂；

17、所述体相共价有机多孔框架(cofs)在溶剂中的浓度可为1-100mg/ml；

18、所述超声处理的功率可为100-300w，具体可为140w，频率可为20-40khz，具体可为20khz，时间可为0.5-12h，具体可为6h。

19、所述将cons从产物中分离的操作可选室温静置3-12小时后取上层液或1000-5000rpm离心5-10分钟后取上层液。

20、本发明的另一方面，提供上述共价有机多孔框架纳米片(cons)作为荧光探针在疏水肽、亲水肽和蛋白质检测中的应用。

21、本发明还提供一种定量检测疏水肽的方法，

22、本发明所提供的定量检测疏水肽的方法，包括如下步骤：将cons荧光探针均匀分散在溶剂中得到荧光探针溶液，将已知的不同浓度的目标疏水肽溶液及空白对照分别与荧光探针溶液混合，静置，检测所得混合液的荧光强度，计算得到荧光猝灭率，建立浓度-荧光猝灭率线性标准曲线，将待测疏水肽溶液与荧光探针溶液混合，静置，检测所得溶液的荧光强度，计算得到荧光猝灭率，根据浓度-荧光猝灭率线性标准曲线计算疏水肽溶液的浓度实现疏水肽的定量分析。

23、其中，荧光猝灭率通过如下公式计算：(f0-fx)/f0

24、fx表示实验组的荧光强度，f0表示空白对照组的荧光强度。

25、上述方法中，所述溶剂具体可为水，不同浓度的乙醇溶液。

26、所述目标疏水肽溶液，可使用水、不同比例的乙醇、pbs、生理盐水作溶剂。

27、所述静置的时间可为3-60min，具体可为5min。

28、所述混合液中cons荧光探针的浓度可为1-100μg/ml。

29、所述cons荧光探针对疏水肽的定量线性范围为5-1000ng/ml。

30、采集在最大发射波长处的荧光强度；如将激发波长设定为360nm，采集530nm处的荧光强度值。

31、本发明的最后一个方面提供一种亲水肽和蛋白质定量检测方法。

32、本发明所提供的亲水肽和蛋白质定量检测方法，包括如下步骤：将cons荧光探针均匀分散在溶剂中得到荧光探针溶液，利用分解酶将已知的不同浓度的亲水性目标肽或蛋白质酶解，得到包含小分子肽段混合物的酶解产物；将目标亲水肽或蛋白质标准品的酶解产物及空白对照与荧光探针溶液混合，静置，检测荧光强度，计算得到荧光猝灭率；建立浓度-荧光猝灭率线性标准曲线，将待测亲水性目标肽或蛋白质酶解，将所得酶解产物与荧光探针溶液混合，静置，检测所得溶液的荧光强度，计算得到荧光猝灭率；根据浓度-荧光猝灭率线性标准曲线计算亲水性目标肽或蛋白质的浓度实现目标亲水肽或蛋白质的定量分析。

33、上述方法中，所述溶剂具体可为水，不同浓度的乙醇溶液。

34、所述亲水性目标肽或蛋白质酶解前溶解于磷酸盐缓冲液、碳酸氢铵溶液中。

35、所述分解酶可将肽和蛋白质酶切为小分子肽段，包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶，优选胰蛋白酶。

36、所述酶解时间为0-72小时，需要对酶解时间和酶的用量进行优化。

37、所述静置的时间可为3-60min，具体可为5min。

38、采集在最大发射波长处的荧光强度。

39、本发明的共价有机多孔框架纳米片(cons)是一种二维纳米材料，除了拥有cofs的结构稳定、比表面积大、结构多样性高等特点，还具有可调控的光学和电子性质以及良好分散性，在吸附分离、荧光和传感领域表现出良好的应用前景。本发明同时发挥cons的发光特性和吸附能力，能够实现快速、无损、高灵敏的肽测定。这对于肽类药物和生物标志物的临床检测和相关研究具有重要意义。

40、本发明提供的共价有机多孔框架纳米片(cons)肽检测探针及其制备方法和应用方法，能够取得以下有益结果：

41、(1)本发明提供的荧光探针具有独特的纳米片结构、良好的稳定性和光学性质，且制备方法简便、通用性强。cofs结构多样，本制备方法可将各类荧光cofs原料制备成疏水肽响应的荧光探针。

42、(2)本发明提供的cons荧光探针在疏水肽检测中的应用方法无需对目标肽进行化学标记、除盐等样品前处理过程，具有快速便捷和抗基质干扰的特点，目标肽和探针混合后的五分钟内即可读取荧光数据，实用性强。

43、(3)本发明提供的cons荧光探针在疏水肽检测中的应用方法的定量线性范围为5-1000ng/ml，具有高灵敏的特点，有望用于痕量肽的快速检测。

44、(4)本发明提供的cons荧光探针在疏水肽检测中的应用方法采用无损的荧光传感策略，不依赖于肽分析物的固有荧光或任何化学衍生物，具有良好的通用性。

45、(5)本发明提供的cons荧光探针在亲水肽和蛋白质检测中的应用方法，通过先酶切后检测的策略，有效拓展了疏水肽响应荧光探针的应用范围，将该探针推广为一种通用性肽检测手段。