一种制备基于分子信标的阳离子脂质体的方法及其产品和应用

本发明涉及一种制备基于分子信标的阳离子脂质体的方法及其产品和应用，属于体外诊断领域。

背景技术：

1、急性心肌梗死(ami)是严重危害人类生命健康的重大疾病之一，具有发病急骤、进展迅速、易触发并发症、致死率高等特点，极有可能导致某些患者的突然性死亡。因此，ami的早期诊断对于挽救心梗患者生命，降低心梗死亡率，提高心梗治疗效果具有十分重要的意义。心电图是目前诊断ami最广泛、直观、有效的工具。但是，心电图诊断本身仍存在一定的局限性，通常不足以诊断急性心肌缺血或梗死，临床上需要与患者血液样本中心脏标志物的检测共同使用来确保诊断的准确性。传统的心脏标志物，如心肌肌钙蛋白i(ctni)对ami的特异性较好，但其释放较晚，在3～6h开始释放，10～24h达到高峰。这种延迟释放对于临床中争分夺秒的诊治来说存在一定的局限性。因此，寻找更早释放、能更快速检测到的、更加准确、高通量、高性价比的心肌标志物对于ami的早期诊断具有重要价值。

2、与心电图、ctni标志物等传统诊断方法相比，外泌体中的mirna标志物(mir-208a)能够被更早地检测到，且具有更加优异的心肌特异性。mir-208a由α-肌球蛋白重链(mhc)基因(myh6)的内含子编码，仅由心肌细胞表达。mir-208a在ami早期1～3h内显著升高到可检测的水平，且其水平与心肌梗死区域释放的ctni和ck-mb含量密切相关。然而，mirna的检测往往需要对外泌体进行提取、裂解，对mirna进行纯化、反转录、扩增等复杂繁琐的步骤，耗时耗力，不利于mirna的快速检测。

3、近年来，脂质体融合技术被应用于外泌体内容物的检测。脂质体具有较高的生物相容性、无细胞毒性、非免疫原性，并且可以对敏感药物进行良好的保护使其在递送的过程中免被降解。对脂质体进行表面修饰可以达到靶向递送的目的，能够增加在血液中的循环时间从而有效改善药物代谢动力学。其递送功能的实现，在很大一方面是基于脂质体与目标细胞或者外泌体的膜融合。目前，促进脂质体与其他膜材料融合的方法主要有冻融法、挤出法，膜表面静电相互作用以及化学物质介导等方法。在这些方法中膜表面静电相互作用以及化学物质介导因操作简单、不会对脂质体膜结构造成损伤。因此，探索有效的促融剂以及融合方法是实现mirna快速检测的关键。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种制备基于分子信标的阳离子脂质体的方法及尺寸均一、表面带有正电荷、具有较高包封率和良好稳定性的产品和在制备检测急性心肌梗死试剂中的应用。

2、技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备基于分子信标的阳离子脂质体的方法，包括以下步骤：将含有1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇的混合溶液与分子信标溶液混合，超声，透析纯化得到所述阳离子脂质体；所述混合溶液为乙醇混合溶液；所述分子信标呈发夹结构，所述发夹结构包括一个与目标分子特异性结合的环部区域和两个茎部区域；所述环部区域的长度为15～30个碱基；两个茎部区域分别为3’端修饰的淬灭基团和5’端修饰的荧光基团。

3、其中，所述3’端修饰的淬灭基团包括6-羧基荧光素；所述5’端修饰的荧光基团包括4-((4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸。

4、其中，所述分子信标为mb-208a，其结构为

5、5'(6-羧基荧光素)-cgcgtacacaagctttttgctcgtcttatgtacgcg-(4-((4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸)3'。

6、其中，所述1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇的摩尔比为49：49：2；所述1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇的总和与mb-208a分子信标的质量比为200：1。

7、其中，分子信标溶液的浓度为100μm。

8、其中，所述超声的功率为1.6～40w；所述超声的时间为0～5min。

9、本发明还提供了一种由所述方法制备的基于分子信标的阳离子脂质体。

10、本发明还提供了一种检测试剂，其含有所述的基于分子信标的阳离子脂质体。

11、其中，还含有dsn酶溶液和peg溶液。

12、其中，所述peg的分子量为6000～20000。

13、优选地，所述peg的分子量为6000～10000，此时能够有效促进分子信标与靶标分子的融合。

14、优选地，所述peg的分子量为8000～10000。

15、其中，所述peg溶液的质量浓度为10％w/v～50％w/v。

16、优选地，所述peg溶液的质量浓度为30％w/v～50％w/v。

17、其中，所述dsn酶溶液浓度为2u/μl。

18、本发明还提供了所述的基于分子信标的阳离子脂质体或所述的检测试剂在制备检测急性心肌梗死试剂中的应用。

19、其中，所述基于分子信标的阳离子脂质体、dsn酶溶液和peg溶液分别和待测血清、正常人血清混合孵育，检测518nm处的荧光信号强度；当待测溶液的荧光信号强度高于正常人血清的荧光强度时，表明提供待测血清的人患有急性心肌梗死；当待测溶液的荧光信号强度不高于正常人血清的荧光强度时，表明提供待测血清的人没有患急性心肌梗死。

20、其中，所述孵育的温度为35℃～51℃；时间为0～60min。

21、本发明还提供了一种包载靶标分子的阴离子脂质体，所述靶标分子为ssdna-208a，所述阴离子脂质体由亚油酸、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺和1，2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇组成。

22、其中，ssdna-208a的浓度为3.76～150.32nm。

23、本发明还提供了一种脂质体融合方法，包括以下步骤：以peg溶液作为促融剂，将所述基于分子信标的阳离子脂质体与包载靶标分子的阴离子脂质体孵育即可得到融合脂质体。

24、其中，所述peg的分子量为6000～20000。

25、优选地，所述peg的分子量为6000～10000，此时能够有效促进分子信标与靶标分子的融合。

26、优选地，所述peg的分子量为8000～10000。

27、其中，所述peg溶液的质量浓度为10％w/v～50％w/v。

28、优选地，所述peg溶液的质量浓度为30％w/v～50％w/v。

29、其中，所述孵育的温度为35℃～51℃；时间为0～60min。

30、反应机理：如图8所示，外泌体表面带负电，能够通过静电相互作用与阳离子脂质体进行融合。其中，peg为促融剂，能够帮助膜表面脱去结合水，使膜相互靠近以促进融合。加入双链特异性核酸酶(dsn)对信号进行放大。阳离子脂质体与外泌体融合后，mb-208a与mir-208a通过碱基互补配对形成双链结构，dsn酶能够特异性切割异源双链中的dna，从而释放mir-208a并引发下一轮目标循环反应，实现信号放大。

31、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：1、本发明利用乙醇注入法制备阳离子脂质体，通过对超声功率、超声时间、注入速度、缓冲溶液盐浓度等多种反应条件的调控，得到了尺寸均一、表面带有正电荷、具有较高包封率和良好稳定性的阳离子脂质体；2、构建了基于包载了分子信标的阳离子脂质体检测体系；3、利用阳离子脂质体与外泌体进行融合，无需对外泌体进行离心提取、裂解、纯化及反转录扩增mirna等复杂繁琐的操作，即可通过分子信标的荧光信号强度对外泌体中的mir-208a进行检测。