一种多功能有机余辉发光纳米材料及其制备方法与应用

本发明涉及纳米材料，具体涉及一种多功能有机余辉发光纳米材料及其制备方法与应用。

背景技术：

1、光学成像是一种利用光学检测设备实现光信号可视化的成像技术，具有成像灵敏度高、时空分辨率高、显像剂成本低等优点，是生物医学应用中不可或缺的工具。相较于荧光成像依赖于实时光激发而产生强的背景噪声，存在低成像信噪比的限制，余辉发光可以在光激发停止后持续发光，由于其无需实时光激发而具有更高的成像信噪比及组织检测深度，且该成像技术依赖于分子自身的光学性质，具有更为优越的灵活性及广泛的适用性，是一种极具潜能的光学成像技术。近来随着临床转化的迫切需求，开发超声激发余辉发光成像以及光声成像等多功能、多模态体系将极大改进光学成像的组织穿透能力，有望实现深部组织成像，推动向临床转化的发展。

2、目前，余辉发光材料主要分为无机余辉发光材料和有机余辉发光材料。无机余辉发光材料通常由过渡金属或稀土金属掺杂的无机盐而构成(例如：znga2o4:cr3+、sral2o4:eu2+/dy3+)；而目前已报导的有机余辉发光材料，主要分为两大体系，一是由单个余辉分子构成有机余辉纳米体系，其主要包括以聚对苯撑乙烯类聚合物(例如mehppv)、噻吩类聚合物(例如pfodbt)为代表的半导体聚合物，二氢卟吩类光敏剂(例如ce4)，光敏剂与化学发光底物共轭连接分子(例如tpp-do)；二是多组分的有机余辉纳米体系，其通常由余辉引发剂，即光敏剂(例如ncbs)、余辉发光底物，即化学发光物质(例如do、so、金刚烷烯醚(aees)、荧光素类似物(cla))、余辉继发单元共同掺杂而构成。

3、但是无机余辉发光材料合成条件苛刻，且要掺入稀土金属等重金属元素，存在较大的生物毒性。相比之下，有机余辉发光材料生物相容性较好、发光可调、合成简便、易实现功能化修饰、价格低廉等优点，在生物医学成像领域有着更广阔的应用前景。对于有机余辉发光材料而言，多组分掺杂的有机余辉纳米体系，由于组成复杂需要花费较多的努力和时间进行条件优化，且存在较差的重复性及有限的余辉发光强度等限制，而单组分有机余辉纳米体系组成简单、合成简便而更具优势。其中半导体聚合物作为一种重要的单组分有机余辉发光物质，其在生物降解性和生物长期安全性方面仍没有有机小分子材料有优势，但目前已报道的有机小分子存在种类单一、发射波长较短、余辉强度较弱等问题。同时，当前已报道的超声激发的有机余辉体系仅有基于声敏剂作为引发剂与化学发光底物作为发光底物的共掺杂纳米体系，存在种类单一、依赖于多组分体系等局限。

4、成像引导的肿瘤切除手术，可以帮助术者快速且准确地判断病灶位置，精准切除病灶或避开重要部位。术中成像技术的发展，使得外科手术变得更快捷、更精确、更安全，这对于患者的预后转归有着重要意义。目前，光学成像凭借其高灵敏度、低成本、实时信号采集等优势，在图像引导切除肿瘤手术中成为一种极具吸引力的成像策略。目前美国食品药品监督管理局(fda)已批准吲哚菁绿(icg)应用于临床荧光成像引导的肿瘤切除手术中。对于当前的荧光成像引导肿瘤切除手术中，由于荧光成像需要实时光激发而产生较高的组织自发荧光干扰，因此产生较高的背景信号，降低其成像信噪比，从而干扰术中判断，影响手术的精准切除效果。因此，具有极低组织背景信号、优越成像灵敏度等巨大优势的余辉发光成像，是成像引导的肿瘤切除手术中一种更为理想的成像方式。近年来，可激活光学探针设计，利用肿瘤高表达的生物标志物特异性地打开光学信号，有助于肿瘤准确检测，提高肿瘤切除的精度。而对于目前已被探究应用于手术导航的有机余辉探针大多数都属于常亮型探针，肿瘤检测的精确度有限。

5、可激活型探针设计依赖于对特定生物标志物的响应，经历一个从“信号关闭”到“信号打开”的激活过程，相较于传统“常亮型”探针，具有更高的信噪比。近年来，该设计策略已被广泛应用于多种光学成像探针的设计，以实现在分子水平上对生理、病理过程的监测。对此，可激活型有机余辉探针的设计开发，可以提供更高的空间、时间精度，无疑将成为获取极高信噪比的一种理想成像方式。

6、目前，对于可激活有机余辉探针的设计策略大多依赖于多组分有机余辉纳米体系，主要包括：一是附加光淬灭剂(例如bhq-2)，利用余辉发光底物与光淬灭剂之间的能量传递，实现余辉发光的淬灭；二是掺杂可激活型光敏剂，利用生物标记物响应的单线态氧产生，为余辉发光底物提供氧化条件，实现后续的余辉发光过程；三是设计可激活型余辉底物，提供生物标记物响应的活性中间体产生，实现后续的余辉发光过程；四是设计可激活型荧光分子作为余辉继发单元，通过能量传递实现生物标记物响应的长余辉发射。对于当前可激活的有机余辉材料设计，大多依赖于多组分体系而存在组成复杂、重复性较差等局限，且由于较为低效的可激活策略而导致激活对比度有限，使其在生物成像应用中受限。

7、目前，有机余辉发光成像正处于新兴发展阶段，开发一种新型的、具有强且近红外发射的有机余辉材料，在提高其光学性能的同时满足可激活设计、声致余辉发光、光声成像等多功能一体化的需求，将实现有机余辉成像发展的重大突破。

技术实现思路

1、为解决目前有机余辉发光材料受限于多组分掺杂体系而造成的费时、重复性低等问题，单组分纳米体系种类单一，半导体聚合物存在的生物降解性和生物安全性等问题，以及目前单组分体系余辉发光波长短，余辉发光强度低等问题，还有目前超声激发有机余辉发光体系种类单一且受限于多组分纳米体系等问题，本发明的首要目的是提供一种多功能有机余辉发光纳米材料及其制备方法。

2、为解决目前可激活有机余辉探针设计策略单一、低效而导致低激活对比度以及目前光学成像引导的手术治疗中背景信号高、常亮型余辉探针在肿瘤检测精确度有限而造成的误诊问题，本发明的进一步目的是提供一种可激活型多功能有机余辉发光纳米材料及其制备方法。

3、本发明的第三个目的是提供可激活型多功能有机余辉发光纳米材料作为纳米探针的应用，可解决目前集余辉发光成像、光声成像等深部组织成像于一体的多功能探针空缺的问题。

4、本发明的第四个目的是提供可激活型多功能有机余辉发光纳米材料在生物成像中的应用。

5、本发明通过以下技术方案实现：

6、本发明第一方面提供一种多功能有机余辉发光纳米材料的制备方法，包括以下步骤：将亚甲基蓝衍生物(mmb)、两亲性共聚物a和两亲性共聚物b于有机溶剂中混合均匀，在超声的条件下加入水中形成纳米颗粒溶液，去除纳米颗粒溶液中的有机溶剂后得到所述多功能有机余辉发光纳米材料(san-m)；

7、所述亚甲基蓝衍生物(mmb)选自如下结构中的一种：

8、

9、

10、所述两亲性共聚物a为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物；

11、所述两亲性共聚物b为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和/或聚苯乙烯-聚丙烯酸。

12、本发明通过对传统的光敏剂亚甲基蓝的烷基化修饰，合成了一个具有良好疏水性的亚甲基蓝衍生物(mmb)。随后，将该衍生物分子与两亲性聚合物通过共组装的方法构建一种结构稳定的纳米颗粒(san-m)。

13、其中，两亲性共聚物a优选为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物(peg-b-ppg-b-peg)；两亲性共聚物b优选为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg2000)和/或聚苯乙烯-聚丙烯酸(ps-paa)。

14、进一步地，所述亚甲基蓝衍生物的制备方法包括以下步骤：

15、s1.将碘溶液滴加到吩噻嗪溶液中得到混合溶液，将混合溶液在冰浴中搅拌反应，过滤收集沉淀物并洗涤干燥得到黑色粉末(产物1)；

16、s2.将二丁胺加入到产物1的有机溶液中，室温下搅拌反应过夜，柱层析分离进一步纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇体积比50：1)，得到深紫色固体(产物mmb)。

17、进一步地，所述亚甲基蓝衍生物、两亲性共聚物a和两亲性共聚物b的质量比为1:200:(5～20)。

18、进一步地，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇和四氢呋喃中的一种或几种，优选四氢呋喃。

19、本发明第二方面提供第一方面所述的方法制备得到的多功能有机余辉发光纳米材料。

20、本发明的多功能有机余辉发光纳米材料(san-m)在660nm光预照射后，可实现波长在710nm的强余辉发射，此外，该近红外余辉发光现象也可在超声预激发后实现。除了余辉发光，san-m也可检测到发射波长在680nm的光声信号，可以实现集余辉发光(afterglow)、荧光(fluorescence)、光声成像(photoacoustic imaging,pa)于一体的多功能、多模态成像，可用于早期炎症成像、肿瘤成像等。

21、本发明第三方面提供一种可激活型多功能有机余辉发光纳米材料的制备方法，包括以下步骤：将亚甲基蓝衍生物(mmb-onoo-)、两亲性共聚物a和两亲性共聚物b于有机溶剂中混合均匀，在超声的条件下加入水中形成纳米颗粒溶液，去除纳米颗粒溶液中的有机溶剂后得到所述可激活型多功能有机余辉发光纳米材料(san-mo)；

22、所述亚甲基蓝衍生物(mmb-onoo-)选自如下结构中的一种：

23、

24、所述两亲性共聚物a为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物；

25、所述两亲性共聚物b为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和/或聚苯乙烯-聚丙烯酸。

26、亚甲基蓝衍生物(mmb)具有结构可控的光学性质，通过在其吩噻嗪环上10号氮位点引入响应基团(例如苯硼酸酯)获得了可激活型有机余辉分子(mmb-onoo-)，通过破坏其中心的共轭结构实现了基于其自身结构的余辉淬灭。由该分子构成的纳米颗粒(san-mo)在特定生物标记物(例如过氧亚硝酸根，onoo-)的触发下，伴随共轭结构的恢复，实现包括余辉发光、荧光、光声信号在内的光学信号经历从“关闭”到“打开”的激活过程，且余辉信号具有极高的激活对比度。

27、其中，两亲性共聚物a优选为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物(peg-b-ppg-b-peg)；两亲性共聚物b优选为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg2000)和/或聚苯乙烯-聚丙烯酸(ps-paa)。

28、进一步地，所述亚甲基蓝衍生物的制备方法包括以下步骤：

29、将mmb溶于二氯甲烷，并与连二亚硫酸钠(na2s2o4)、碳酸氢钠(nahco3)的水溶液混合，在室温并于氮气保护下搅拌，直至有机相的颜色由蓝色变为黄色后，去除水相。向上述反应液中加入三乙胺(tea)和三光气(tpg)，反应1～2h后真空浓缩。残留物以二氯甲烷为洗脱剂进行闪烁柱层析分离纯化，得到黄色产物(产物2)。接着，将碳酸钾(k2co3)、4-二甲氨基吡啶(dmap，)和4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯混合溶于二氯甲烷溶液中，向其中滴加入产物2，并在氮气保护下室温搅拌，直至薄层色谱分析显示反应完成。真空浓缩，残留物以二氯甲烷为洗脱液进行闪烁柱层析分离纯化，得到淡蓝色产物(mmb-onoo-)。

30、进一步地，所述亚甲基蓝衍生物、两亲性共聚物a和两亲性共聚物b的质量比为1:200:(5～20)。

31、进一步地，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇和四氢呋喃中的一种或几种，优选四氢呋喃。

32、本发明第四方面提供第三方面所述的方法制备得到的可激活型多功能有机余辉发光纳米材料。

33、本发明第五方面提供第四方面所述的可激活型多功能有机余辉发光纳米材料作为纳米探针的应用。

34、本发明的可激活型多功能有机余辉发光纳米材料可作为可激活型有机余辉纳米探针，利用肿瘤内高表达的过氧亚硝酸根特异性识别并激活本发明的可激活型有机余辉纳米探针，得益于可激活型余辉发光极高的信噪比，从而实现对肿瘤的精准检测并在余辉图像引导下实现微小肿瘤的精准切除。

35、本发明第六方面提供第四方面所述的可激活型多功能有机余辉发光纳米材料在生物成像中的应用。

36、本发明的可激活型多功能有机余辉发光纳米材料可以实现集余辉发光、荧光、光声成像于一体的可激活型多模态成像。

37、本发明的有益效果：

38、1.本发明的多功能有机余辉发光纳米材料主体为有机小分子，其在生物相容性、生物可降解性、发光优越性及可调性、结构灵活性等方面具有显著优势。

39、2.本发明的多功能有机余辉发光纳米材料在光激发停止后，可以发出强度高、波长为710nm的余辉发光，此余辉发光位于近红外波段，因此，具有更为优越的组织穿透性，易实现深层组织成像。

40、3.本发明的多功能有机余辉发光纳米材料可以实现在超声激发停止后，发出波长710nm的近红外余辉发光，属于声致余辉发光现象，超声具有更深的组织穿透能力，因而，易实现深层组织成像。

41、4.本发明的多功能有机余辉发光纳米材料存在光声信号，可实现光声成像，可应用于深部组织成像。

42、5.本发明的多功能有机余辉发光纳米材料在实现近红外余辉波长发射的同时提高余辉发光强度，且具有超声激发余辉发光的深组织穿透潜能，可实现集合荧光、光声、余辉发光的多功能成像一体化，实现对生物标记物相关的高灵敏度、高对比度的多模态分子成像。

43、6.本发明的多功能有机余辉发光纳米材料的主体有机小分子具有结构可调控的光学性质，易于实现基于自身主体结构的可激活设计，发展单组分可激活有机余辉纳米体系，且具有极高的激活对比度。

44、7.本发明的可激活型多功能有机余辉发光纳米材料可作为可激活型有机余辉纳米探针，利用肿瘤内高表达的过氧亚硝酸根特异性识别并激活本发明的可激活型有机余辉纳米探针，得益于可激活型余辉发光极高的信噪比，可以实现最小直径约为1.5mm的微小肿瘤的精准检测并在余辉图像引导下的精准切除。