一种微生物土壤活化菌剂及其制备方法与应用与流程

本发明属于微生物材料，具体涉及一种微生物土壤活化菌剂及其制备方法与应用。

背景技术：

1、重金属是指一些具有生物毒性的金属和类金属，如镉、汞、砷、铅、铬等。目前土壤重金属污染问题日益备受关注。在城市重金属污染的土壤中，酶和微生物会受到抑制甚至杀死，这将严重破坏土壤生态链，影响土壤的生物活性，从而限制作物生长。

2、针对土壤重金属污染治理可通过采用物理、化学或者生物治理的手段。物理、化学手段对重金属污染的土壤进行修复不仅效果差，而且还存在对土壤造成二次污染的风险。当前，通过微生物对土壤中的重金属进行高效溶解，从而促进植物对重金属元素的吸收；根际微生物与其他微生物不同，其在对重金属溶解的同时还可大量分泌植物激素，从而促进植物的生产发育，继而提高了植物对重金属的修复效率。

3、但是目前微生物对于土壤重金属元素的治理，多集中与多种金属元素的修复，且功能单一、菌种复杂，很难得到有效的利用和实施。例如：申请号为cn201610252293.1的专利，公开了一种用于改良土壤重金属的微生物剂，包括光合细菌、放线菌、乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、固氮菌、柠檬酸细菌、地衣芽孢杆菌以及为上述菌群提供营养的基质，用于改良土壤重金属的微生物剂。申请号为cn202311153948.6，公开了一种修复重金属污染土壤的微生物复合菌剂，每100份微生物复合菌剂包括以下重量份数的组分：粪纤维单胞菌5份、硝基还原假单胞菌10份、蛋白胨30份、酵母膏35份和氯化钠20份。

4、因此，如何开发一种高效的微生物土壤活化菌剂，在高效去除土壤重金属元素的同时，活化土壤环境，提升其生态活性和土壤肥力，是目前接亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中存在的问题，优化分离一株哈茨木霉菌，与筛选的褐球固氮菌以及香鱼假单胞菌组成功能微生物菌种，在微生物活化剂和载体的共同作用下，可实现土壤中重金属元素的高效清除，兼具促生和调节土壤的作用。

2、为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种微生物土壤活化菌剂，包含功能微生物发酵液、微生物活化剂以及微生物载体，三者质量比为1:0.5:5。

4、优选的，所述微生物活化剂为海藻酸钠和葡萄糖按照质量比1:（0.5-1.5）混合得到。

5、优选的，所述微生物载体为麸皮、硅藻土、生物质炭和鱼骨粉按照质量比（5-8）:（3-5）:（3-6）:（1-3）混合得到。

6、优选的，所述功能微生物发酵液包含哈茨木霉菌（trichoderma harzianum）、褐球固氮菌（azotobacter chroococcum）以及香鱼假单胞菌（pseudomonas plecoglossicida）。

7、优选的，所述哈茨木霉菌（ trichoderma harzianum）的保藏编号为cgmccno.40702，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年6月16日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

8、本发明哈茨木霉菌分离自山东省济宁市微山县境内一处铁尾矿，采样地包括砷、铅在内的多种重金属含量均超标。

9、分离方法为：取5g土样置于灭菌后的pda培养基，加入过滤除菌后的亚砷酸钠溶液，使as3+浓度为50mg/l，富集培养24h后，以2%的接种量转接至as5+浓度为100mg/l的培养基中，以相同条件培养，并逐步提高as5+浓度，转接5次后进行稀释涂布，分离并保存长势最好的菌株，即为目标菌株哈茨木霉菌。

10、菌株形态特征：菌落在pda平板上25-28℃培养4天扩展5cm，深灰绿色；菌丝具隔膜，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分生孢子近球形、卵形，绿色，壁光滑。

11、所述褐球固氮菌的保藏编号为cgmcc no.1.5803，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2005年6月27日；所述香鱼假单胞菌的保藏编号为cgmcc no.1.16111，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2017年3月29日。褐球固氮菌、香鱼假单胞菌均可通过保藏中心菌种目录开放购买，无需进行额外保藏。

12、一种微生物土壤活化菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：

13、(1)将哈茨木霉菌、褐球固氮菌以及香鱼假单胞菌解冻后分别接种于pda培养基中，进行活化培养；活化培养后，挑取各菌株的菌饼皆以1.5%的接种量分别加入混合发酵液体培养基中进行发酵培养，当各混合发酵液体培养基中的有效活菌数达到4×108cfu/ml时，停止发酵，得到三种发酵菌液，再将三种发酵菌液按照体积比1:1:1混合后，得到功能微生物发酵液；

14、(2)将麸皮、硅藻土、生物质炭和鱼骨粉灭菌后按照质量比8:3:3:1混合，加入海藻酸钠和葡萄糖，搅拌混合均匀后，置于造粒机中进行造粒，得到粒径为2-4mm的固体颗粒；

15、(3)将步骤（2）得到的固体颗粒加入到功能微生物发酵液中进行吸附，后自然干燥，得到终产品。

16、步骤（1）活化培养方法为：将哈茨木霉菌、褐球固氮菌以及香鱼假单胞菌解冻后分别接种于pda培养基中，25-28℃培养，待菌丝长至平板三分之二时，用6mm的打孔器把基础pda培养基中的菌落打成菌饼，完成活化培养。

17、所述pda培养基的配方和制法是，马铃薯200克，加水煮沸至少30分钟，过滤后取滤液，再加葡萄糖20克、琼脂15-20克，加水至1000毫升，自然ph值，使用前灭菌处理。

18、所述混合发酵液体培养基的组成为：5-7g葡萄糖、10-15g酵母粉、0.1-0.15gkh2po4、0.1-0.15gmgso4，3-5g氯化钠，蒸馏水1000ml，并蒸汽高温121℃灭菌20min自然ph值。

19、混合发酵液体培养基中进行发酵培养的方法为：25-28℃培养，200r/min条件下摇床培养。

20、优选的，步骤（2）造粒时，加入麦芽糖或者淀粉作为粘结剂，促进造粒。

21、一种微生物土壤活化菌剂的应用，所述菌剂用于修复活化重金属污染土壤。

22、更优选的，所述菌剂用于修复活化砷元素污染土壤。

23、本发明所用原料均市售可得。

24、本发明土壤微生物活化菌剂的用量为5-10kg/亩。使用方法为将土壤修复剂与待修复土壤混合均匀，喷水至土壤湿度为60-70％，养护5-10天即可。

25、有益效果

26、（1）本发明筛选得到一株哈茨木霉菌，具有胞外吸附和金属络合作用，可以通过调节还原酶和相关基因的表达来实现金属离子的还原与外排，首先通过表面的官能团和蛋白质等物质可与重金属离子结合，再通过生物还原过程将重金属离子还原为低价态或稳态，从而重金属离子的固定和清除，特别对于砷离子去除效率较高，同时具备解磷、固氮和产iaa能力，具有调节土壤和促进作物生长的作用；

27、（2）褐球固氮菌不仅仅具有良好的固氮能力，调节土壤营养结构，同时其可以产生胞内吸附作用可以把重金属元素与络合素等相结合后形成热稳定蛋白，使重金属元素毒性在该过程中得到弱化或消失；香鱼假单胞菌不仅具有金属络合作用，其还可以分泌有机酸、生物表面活性剂等成分，提升哈茨木霉菌以及褐球固氮菌活性，促进其功效的发挥；

28、（3）本发明哈茨木霉菌与褐球固氮菌以及香鱼假单胞菌等比例组合后，相互作用显著，可以提升重金属的去除效率。同时协同促生；三种微生物还可以调节土壤营养物质含量，特别调节土壤各类酶活性，修复土壤生态活性，社会效益和经济效益显著。