一种硅包彩色荧光微球及其温和制备方法和应用

本发明涉及免疫层析，具体领域为一种硅包彩色荧光微球及其温和制备方法、用途。

背景技术：

1、免疫层析技术是20世纪末发展起来的结合免疫技术和色谱层析技术的一种分析方法，该方法具有特异性、操作简单、快速等特点，广泛用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域。时间分辨荧光免疫层析技术作为一种新型免疫检测技术，是在荧光免疫层析技术上发展而来，通常是内部包埋有稀土配合物的表面羧基化的聚苯乙烯微球，通过化学结合与抗体偶联，通过荧光强度对待检测物实现定量分析的目的。

2、时间分辨荧光微球作为时间分辨免疫层析关键原材料，传统的制备方法主要是溶胀法，其制备方法为：第一，先制备出表面羧基化的聚苯乙烯微球；第二，一般选用稀土元素化合物如eu2o3、eucl3·6h2o、yb2o3等，与二酮配体以及菲罗啉等反应制备单核稀土三元配合物，然后将时间分辨荧光染料和羧基化聚苯乙烯微球在溶胀剂及表面活性剂存在的条件下，将染料包埋进微球内部。

3、cn116218516a公开了一种时间分辨荧光微球及其制备方法和应用，具体为(1)采用无皂乳液聚合法将苯乙烯与羧基功能单体聚合，得到表面羧基化的聚苯乙烯微球；(2)以氯化铕、1,3-二苯基-1,3-丙二酮和4,7-二苯基-1,10-菲罗啉为原料合成eu(l1)3(l2)1稀土单核三元配合物；(3)将稀土配合物通过溶胀法包埋至羧基聚苯乙烯微球内部，得到时间分辨荧光微球。这种方法步骤繁琐，需先通过乳液聚合法制备表面羧基化聚苯乙烯微球，聚合温度高，毒性大，聚苯乙烯疏水性强，易于凝集，单核稀土三元配合物发光强度低，采用溶胀法制备时间分辨荧光微球的微球内部染料易于泄露，而且在免疫层析的实验中及应用中，微球自身的白色或者淡黄色使得用户难以肉眼观察不到检测线和质控线，需借助仪器观察并读取数值。

4、cn115466277a公开了一种羧基功能化的时间分辨荧光微球及其制备方法，包括以下步骤：酸性调条件下，将铕盐、镧系金属盐、β-二酮配体、协同配体和桥联配体在有机溶剂中发生反应，得到双核稀土多元配合物eu(ln)(l1)4(l2)2(l3)1；然后将双核稀土多元配合物、苯乙烯单体、丙烯酸类单体、引发剂、聚乙烯吡咯烷酮、乳化剂在溶剂中发生分散聚合反应，得到羧基功能化的时间分辨荧光微球。这种方法虽然可以在聚合阶段将染料直接包埋于微球内部，而且位阻大的双核稀土五元配合物的发光强度更强，但是这种方法制备过程复杂，分散聚合制备聚苯乙烯材质，疏水性强，聚合反应温度高，制备聚合物的过程使用的乳化剂、分散剂聚乙烯吡咯烷酮难以去除干净，微球中残留的乳化剂和聚乙烯吡咯烷酮会影响微球与抗体的偶联效率，影响检测灵敏度；而且，在免疫层析的实验中及应用中，微球自身的白色或者淡黄色使得用户难以肉眼观察不到检测线和质控线，需借助仪器观察并读取数值。

5、cn111218270a公开了一种改性时间分辨荧光微球的制备方法，具体为：(1)在反应釜中加入超纯水并通氮气，边加热边搅拌，加入精馏过得苯乙烯一起混合加热，再加入引发剂，制备白色聚苯乙烯乳胶微球；(2)称取溶剂染料、2-噻吩甲酰三氟丙酮、邻菲罗啉盐酸盐、氯化铕及电子介体若干溶解在石油醚中生成混合物；将上述混合物缓慢滴加到步骤(1)制备的白色乳胶微球溶液中搅拌均匀获得染色时间分辨荧光微球。该方法制备的微球带有鲜艳的颜色且不影响自身荧光强度，用户可以通过肉眼直观的查找异常出现的试纸条。但是这种方法制备的微球，其实是通过溶胀法将单核稀土三元配合物及溶剂染料通过溶胀包埋法包进微球内部而成，步骤繁琐，单核稀土三元配合物发光强度低，染料易于泄露。

6、cn117186872a公开了一种一步法制备彩色时间分辨荧光微球，具体为：将三口烧瓶中的乙醇和水的混合溶液通氮气置换空气，再向体系中加入分散剂和氯化铕搅拌溶解，缓慢加入稀土配体1,10-菲罗啉和2-甲级氨基苯甲酸乙酯的醇溶液，用ncoh调整溶液的ph至6-8，再将溶有引发剂和染料的苯乙烯和功能性单体加入反应体系中，60-80℃反应6-16h，制得单分散彩色时间分辨荧光微球。本方法制备的彩色时间分辨荧光微球，步骤简单，不适用溶胀剂等有机溶剂，但合成聚苯乙烯材质微球，反应温度高，且使用大量分散剂聚乙烯吡咯烷酮，难以去除干净，影响微球与抗体偶联效率，单核稀土三元配合物的发光强度较低。

7、cn106243835a公开一种水性稀土配合物复合微球荧光油墨，将稀土配合物复合微球、丙烯酸酯水溶液、偶联剂、分散剂、消泡剂、助溶剂、成膜助剂、增稠剂、填充剂通过制备混合物a→制备粉体→混合研磨→过滤搅拌处理，制备油墨发光光谱窄、色纯度高、光稳定性好、绿色环保。其中稀土配合物复合微球内部为单核稀土三元配合物eu(dbm)3phen的sio2胶体，粒径约20nm左右，不适合免疫层析领域；而且，该方法先合成单核稀土三元配合物，发光强度低，而且在有大量的有毒溶剂丙酮(约为乙醇的2-4倍)的体系中包埋进二氧化硅微球内部，最终得到干燥的稀土配合物复合微球。

8、综上分析，目前制备彩色时间分辨荧光微球的技术存在以下不足：(1)步骤繁琐；(2)多为溶胀法制备，染料易于泄露，微球结构易被破坏；(3)采用聚苯乙烯基质，疏水性强，易于团聚；(4)聚合温度高；(5)毒性大；(6)表面活性剂及分散剂不易去除干净；(7)多为单核稀土三元配合物荧光染料，发光强度低；(8)微球多为白色或者淡黄色，使得用户难以肉眼观察不到检测线和质控线，需借助仪器观察并读取数值。

9、基于此，本领域亟需开发一种反应步骤简单、条件绿色温和、无表面活性剂及分散剂、表面氨基修饰二氧化硅基质、内部包埋发光强度高的双核稀土配合物及油溶性染料、用于免疫层析领域免疫检测的彩色时间分辨荧光微球制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种硅包彩色荧光微球及其温和制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种硅包彩色时间分辨荧光微球的温和制备方法，首先在乙醇体系中合成时间分辨荧光染料，然后加入油溶性染料、乙醇水溶液及溶胀剂二氯甲烷，室温搅拌使染料溶解，再加入氨水和硅烷偶联剂正硅酸四乙酯，反应过夜补加氨水，并逐次加入偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应结束后纯水洗涤数次。

4、进一步的，具体包括以下步骤：

5、(1)在乙醇体系中合成双核时间分辨荧光染料：称取eucl3·6h2o和二苯甲酰甲烷(dbm)溶于适量乙醇中，然后加入三乙胺，搅拌均匀，最后加入1,10-邻菲罗啉(phen)(phen)和1,4-萘二甲酸(nc)，室温反应2h；

6、(2)采用溶胶凝胶法合成硅包彩色时间分辨氨基修饰纳米微球：室温搅拌后，称取适量油溶性染料于反应瓶中，加入适量乙醇水溶液和二氯甲烷使染料溶解；快速加入适量氨水，搅拌均匀，再逐滴加入偶联剂正硅酸四乙酯，反应过夜；再补加适量氨水，搅拌均匀，分三次逐滴加入偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温反应2天；反应结束后用纯水洗涤3次，保存于纯水中。

7、其中，所述步骤(1)中，第一配体为二苯甲酰甲烷，第二配体为1,10-邻菲罗啉，桥联配体为共轭二羧酸，所述共轭二羧酸为1,4-萘二甲酸。

8、其中，eucl3·6h2o与第一配体的摩尔比为1：2，eucl3·6h2o与第二配体的摩尔比为1：1，eucl3·6h2o与桥联配体的摩尔比为1：0.5。

9、其中，所述步骤(2)中，正硅酸四乙酯为第一偶联剂，在聚合过程中将时间分辨荧光染料和油溶性染料包埋进二氧化硅球体中，再以3-氨丙基三乙氧基硅烷为第二偶联剂对微球表面进行氨基修饰。乙醇水溶液与正硅酸四乙酯的体积比为1:0.05-0.1，乙醇水溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:0.006-0.015。氨水与全部偶联剂的体积比为1：0.8-1.2，全部偶联剂与油溶性染料的质量比为1：0.2-1。

10、本发明上述温和制备方法制备的硅包彩色时间分辨荧光微球可用于免疫层析领域定性和定量双重免疫检测。

11、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

12、本发明制备的彩色时间分辨荧光微球粒径范围200-450nm，通过一步法制备，反应条件温和，毒性低；不使用表面活性剂及分散剂；表面氨基修饰二氧化硅基质，亲水性强，微球分散性好；聚合过程将高发光强度双核稀土铕配合物和油溶性染料包埋进微球内部、染料不易泄露；可用于免疫层析领域，既可实现对待检测物高灵敏度定量检测，又可通过肉眼直观的看到检测线和质控线，快速找出异常试纸条。