一种可检测活细胞线粒体中镍离子的高选择性荧光探针及其制备方法
【专利说明】-种可检测活细胞线粒体中镇离子的高选择性黄光探针及其 制备方法 -、技术领域
[0001] 本发明设及一种单光子光学材料及其制备方法，具体地说是一种具有低毒性、能 对活细胞线粒体中的儀离子有识别能力的化晚基Ξ苯胺类巧光探针及其制备方法。 二、【背景技术】
[0002] 利用活细胞成像工作站进行细胞和基因的功能研究，是生物医学研究的最新趋 势。固定细胞观察仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件 下的状态活细胞观察，对处于正常生理状况下的细胞进行全程扫描和记录，获得其连续、全 面、动态过程。由于其显示的正常细胞动态的活动过程，很容易发现和确定细胞间相互作用 和信号传导的过程，W及在活细胞水平上的生物分子间的相互作用，不仅可W解决长期W 来悬而未解的问题，更为未来的研究提出新的问题，指出新的方向。
[0003] 化学巧光探针在对客体的识别过程中展现出较好的选择性，因而，在环境监测、分 子催化和生物巧光成像等领域展具有潜在的应用价值，受到广泛关注。与传统的检测方法 (如原子吸收光谱和等离子发射光谱、电化学法、比色法、生物和纳米传感器等)相比，化学 巧光探针主要利用测试过程中发生的巧光信号变化(增强、减弱或发射波长位移等)对客体 进行检测，具有成本低廉、操作简单、检测限低、灵敏性和选择性高等优点。活细胞成像技术 正是利用运些巧光探针，比如小分子有机染料或者量子点来特异性的标记感兴趣的分子。
[0004] Ξ苯胺是W氮原子为中屯、，具有星型结构的化合物。由于其具有独特的自由基性 质，较大的空间位阻，超共辆电子效应W及较高的空穴迁移率，因而在光电材料和空穴传输 材料等领域有着广泛的应用。此外，N原子上的孤对电子与周围的苯环形成大的共辆体系， 使得分子的发射波长位于蓝绿光区域，表现出良好的光学特性，被广泛的应用于Ξ维光学 数据存储、巧光探针和细胞成像等领域。 Ξ、
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种具有可检测活细胞线粒体中儀离子的高选择性巧光探针及 其制备方法，所合成的探针为含化晚基Ξ苯胺基胺类衍生物，该探针具备低毒性和良好的 光学性能，能够在细胞线粒体部位成像，并且对儀离子有可逆的探测能力。
[0006] 本发明请求保护的一种具有可检测活细胞线粒体中儀离子的高选择性巧光探针， 其结构式如下：
[0007]
[000引本发明同时请求保护上述高选择性巧光探针的制备方法，所述制备方法步骤如 下：
[0009] A、中间体I的制备
[0010] 冰浴下向容器中依次加入DMF、^氯氧憐和Ξ苯胺，然后升溫至40-70°C，反应14- 1她，所述反应液经分离、洗涂并干燥得淡黄色中间体I;
[0011] B、中间体Π 的制备
[0012] 将硝基甲苯和N-漠代下二酷亚胺(NBS)溶于苯中，在催化剂过氧化苯甲酯(BP0)的 作用下，在60-100°C下反应7-lOh，反应结束后冷却至室溫，过滤并保留过滤液，然后向过滤 液中加入Ξ苯基麟，在40-80°C下反应2-化，反应结束后自然冷却至室溫，过滤、洗涂并真空 干燥后得到黄色中间体Π ;
[001引 C、中间体虹的制备
[0014]将t-BuOK、中间体I和中间体Π 于研鉢中研磨，反应完全后，用C此Cb将反应物溶 解，过滤，浓缩，得树枝状红色中间体虹；
[001引 D、中间体IV的制备
[0016]将中间体虹溶乙醇溶液中，然后加入水合阱，在催化剂Pd/C的作用下，在50-80°C 下回流反应1-化，反应完全后，趁热抽滤，得乳黄色中间体IV。
[0017] E、中间体V的制备
[0018] 将溶解在甲醇溶液中的中间体IV升溫至50-80°C，然后加入冰乙酸、再加入2-化晚 甲醒，回流反应4-化，反应结束后，抽滤得到黄色粉末状中间体V。
[0019] F、目标产物L的制备
[0020] 向反应容器中加入棚氨化钢、溶解在乙醇中的中间体V，10-40°c下反应0.5-化 后，抽滤，乙醇重结晶，得到栋色目标产物L固体。
[0021] 作为优选，所述步骤A中，DMF、^氯氧憐和Ξ苯胺的摩尔用量比为1:1:1。
[0022] 作为优选，所述步骤B中，对硝基甲苯、N-漠代下二酷亚胺(NBS)、S苯基麟摩尔用 量比为1:12:12。
[0023] 作为优选，所述步骤C中，t-BuOK、中间体I和中间体Π 的摩尔用量比为5.4:1.8: 2.2。
[0024] 作为优选，所述步骤D中，中间体虹、水合阱的摩尔用量比为1:10。
[0025] 作为优选，所述步骤E中，中间体IV、2-化晚甲醒摩尔用量比为7.2:9.4。
[0026] 作为优选，所述步骤F中，棚氨化钢、中间体V的摩尔用量比为2:1。
[0027] 与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0028] 1、本发明W具有较高反应活性和良好生物相容性的Ξ苯胺基团作为主体，简洁高 效地制备了 Ξ苯胺硝基衍生物，通过还原反应、缩合反应，得到化晚基Ξ苯胺类巧光探针， 经实验发现，本发明制备的化晚基Ξ苯胺类巧光探针在425nm左右具有良好的单光子巧光 性质（图2) DHepG2细胞被目标产物染色后，可清晰地观察到有机材料对化pG2细胞细胞质中 的线粒体具有高的成像能力，并能可逆地检测线粒体中的儀离子。本发明探针对于有机染 料的设计、制备和生命科学研究具有重大的意义。
[0029] 2、本发明合成的化晚基Ξ苯胺类巧光探针是一类具有细胞质中线粒体成像功能 的单光子光学材料。对细胞无损伤，可用于活体细胞检测，具有明显的应用价值；
[0030] 3、本发明制备方法原料易得，成本低，合成步骤简单，易于操作。 四、
【附图说明】
[0031] 图1为本发明的制备方法路线图。
[0032] 图2是本发明的化晚基Ξ苯胺类巧光探针在乙腊中激发波长368nm下对不同金属 离子的巧光响应图。
[0033] 图3a-3c是化晚基Ξ苯胺类巧光探针对化pG2细胞巧光共聚焦显微成像图，
[0034] 其中图3a是化晚基Ξ苯胺类巧光探针着色的化pG2细胞的巧光共聚焦显微照片； 图3b是明场作用图；图3c是叠合的照片。
[0(X3日]图4a是化晚基Ξ苯胺类巧光探针与线粒体的商品染色剂Mito-Tracker对化pG2细 胞巧光共聚焦显微成像图。图4a中左上图是探针对化pG2细胞巧光共聚焦显微成像;右上图 是商品染色剂Mito-Tracker对化pG2细胞巧光共聚焦显微成像;左下图是对化pG2细胞巧光 共聚焦显微成像的明场图；右下图是化晚基Ξ苯胺类巧光探针与线粒体的商品染色剂 Mito-Tracker对化pG2细胞巧光共聚焦显微成像的暗场叠加图。
[0036] 图4b是化晚基Ξ苯胺类巧光探针与线粒体的商品染色剂Mito-Tracker间的皮尔 森相关系数。 五、
【具体实施方式】
[0037] W下结合附图通过具体实施例对本发明技术方案做进一步解释说明。
[003引 1、中间体I的制备
[0039] 在250mL烧瓶中加入7.4mL(0 . Imol )DMF，冰水浴中揽拌，随后逐滴加入9.2mL (O.lmol)S氯氧憐，继续揽拌，15min后瓶中液体变得粘稠，最后得到白色略带红色固体冻 盐。将100ml含有24.5g(0.1mol)S苯胺的氯仿溶液加入上述烧瓶中，升溫度至50°C约30min 至冻盐全溶，65°C下回流反应16h，薄层色谱法判定反应完全后旋蒸完氯仿，剩余物倒入 lOOOmL冷水中，W碳酸钟调节溶液抑值至弱碱性，有大量黄绿色固体析出，抽滤，旋干溶剂， 残余物经色谱柱分离提纯，洗脱剂是纯石油酸，得到7.81g产物，产率71.5 %。iH應R: (DMS0-d6,400Hz)，δ(卵m):6.89(d，J = 8.80Hz，2H)，7.23(q，細），7.42(t，J = 7.80Hz，4H)， 7.72(d，J = 8.80Hz，2H)，9.771(s，lH)。
[0040] 2、中间体Π 的制备
[0041 ] 在500mL的圆底烧瓶中，分别加入13.7g(0.1mol)对硝基甲苯、21.4g(0.12mol)N- 漠代下二酷亚胺(NBS)溶于150mL的苯中，最后加入0.5g过氧化苯甲酯(BP0)催化剂，升溫至 80°C下回流反应化，薄层色谱法判定反应完全后，冷却至室溫，有白色固体(班巧酷亚胺)析 出，抽滤，滤去白色固体，滤液中加入31.5g(0.12mo 1)Ξ苯基麟，50°C下回流反应3小时;冷 却至室溫有大量的固体析出，抽滤，固体用苯(5mL)洗涂Ξ次，得到39.Og黄色固体。产率为 81.6%</Η NMR:((CD3)2C0,400Hz)，S(ppm):5.98(d J = 8.00,2H)，7.47(d J = 8.40Hz，2H), 7.57-7.62(111，6扣，7.75(1，1 = 7.60化，3扣，7.82(9，細）。
[0042] 3、中间体虹的制备
[0043] 将0.6旨巧.4111111〇1)1：-1311〇1((叔下醇钟)于研鉢中研磨成粉，然后加入1.0旨(2.21]11]1〇1) 漠化(4-硝基苯甲基)S苯基麟（中间体Π )，研磨5min后，另加入0.5g(1.8mmol)4-(N，N-二 苯基氨基)苯甲醒（中间体I)加入研鉢中，研磨，薄层色谱法判定反应完全后。用C出Cl2将其 溶解，过滤，滤液水洗，无水Mgs化g干燥，浓缩，无水乙醇重结晶得0.3：3g树枝状红色固体。产 率为：46.5%。lH匪R:((CD3)2C0,400Hz)，δ(ppm):7.03(d，J = 8.00Hz，2H)，7.13(d，J = 7.20Hz，細），7.38(d，J=16.40，lH)，7.35(dJ = 7.80Hz，4H)，7.51(dJ=16.40Hz，lH)， 7.60(d，J = 8.00Hz，2H)，7.85(d，J = 8.40Hz，2H)，