一种使微载体聚集体保留吸水分散特性的辐照灭菌方法与流程

本发明涉及一种使微载体聚集体保留吸水分散特性的辐照灭菌方法，属于生物技术领域。

背景技术：

细胞微载体指的是直径在10～1000μm，能使用与贴壁细胞生长的微珠。将微载体粉末聚集成聚集体，方便细胞培养的使用，通过粉末聚集而形成的聚集体材料，接触到液体后立即分散为粉末载体颗粒，便于使用，又有利于细胞培养过程中，满足微载体定量使用及单独灭菌的需求。为了方便储存和运输，细胞微载体聚集体以干燥的形式保存，但必须达到无菌且能够在使用时吸水分散，以供细胞培养使用。

传统的微载体采用高温高压灭菌方法，其中步骤包括将微载体浸泡在液体中，因此该方法会破坏微载体聚集体使其在接种细胞前无法保持聚集体的形式，因此不适用于微载体聚集体的灭菌。而目前微载体主要由葡聚糖、纤维素、蛋白质、高分子聚合物(如聚苯乙烯)等有机物组成，因此一般无法进行干热等高温形式的灭菌。因此为了避免高温对微载体的破坏，采用非液态非高温形式的灭菌方法，其中环氧乙烷和辐照灭菌为较长使用的医疗器械灭菌方法。但由于环氧乙烷灭菌会有环氧乙烷、2-氯乙醇等有害物质的残留，若无法完全排出残留物质则将不利于细胞培养或移植体内时将造成人体造成伤害。辐照灭菌使用γ、β等射线进行灭菌，并无有害物质残留，灭菌时温度压力对细胞微载体并无破坏。目前没有文献报道微载体聚集体的灭菌方法。采用上述常规的微载体辐照灭菌方法，可能会引起细胞微载体聚集体中颗粒之间因分子与氧气等发生的化学反应，导致相互交联，导致难以实现吸水分散，而因分子产生变化后可能不利于细胞培养。因此需要一种灭菌后仍可保留微载体聚集体吸水并分散的特性并且无有害物质残留的灭菌方式。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种使微载体聚集体保留吸水分散特性的辐照灭菌方法。

本发明提供的一种使微载体聚集体保留吸水分散特性的辐照灭菌方法，包括如下步骤：将微载体聚集体密封包装后采用辐照灭菌，能使灭菌后的所述微载体聚集体保留吸水分散特性。

上述的方法中，所述微载体聚集体中微载体颗粒的密度可为200～20000个/mm³，具体地实施例中可控制所述微载体聚集体的厚度可为0.5～20mm，具体可为1～10mm。

上述的方法中，所述微载体聚集体中微载体颗粒的密度可为750～2500个/mm³，具体可为750个/mm³、1000个/mm³、1529个/mm³、1300个/mm³、750～1300个/mm³或750～2000个/mm³；具体地实施例中可控制所述微载体聚集体的厚度可为1～5mm。

上述的方法中，所述辐照的辐照源选自钴源的γ射线、电子加速器产生的β射线和x射线发生器所产生的x射线中的至少一种。

上述的方法中，所述辐照的剂量可为1～50kgy，具体可为2.5～20kgy。

上述的方法中，所述辐照的剂量可为15～20kgy。

上述的方法中，所述密封包装的形式选自真空密封包装和/或填充氮气、二氧化碳、一氧化碳和二氧化硫中至少一种密封包装的形式。

上述的方法中，所述微载体聚集体为细胞微载体聚集体；所述细胞载体颗粒聚集体由细胞载体颗粒聚集而成，且具有特定形状；

所述特定形状包括片状和块状；所述片状或所述块状的截面形状具体为圆形、圆柱形、正方形、菱形、三角形、椭圆形、多角形或多边形；

所述细胞载体颗粒指的是由人工合成的生物材料和/或天然生物材料制备得到的微载体，直径可为1～1000μm。

上述的方法中，所述人工合成的生物材料为选自聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda4000)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少一种；

所述天然生物材料为选自胶原、蛋白多糖、糖蛋白、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、透明质酸、层连接蛋白、纤维连接蛋白或组织脱细胞化材料中的至少一种。

上述的方法中，所述细胞载体颗粒聚集体按照下述方法进行制备：所述细胞载体颗粒在外力作用下聚集成型，即得到所述细胞载体颗粒聚集体；具体地，采用冲压成型的方法将所述细胞载体颗粒聚集成型；所述冲压成型的条件如下：冲压模具为斜平冲模具、浅弧冲模具、深弧冲模具或全平冲模具；冲压成型机上冲的调节范围为0～50mm，下冲的调节范围为0～50mm；压力为0～200kn。

本发明中，所述微载体聚集体具体为按照专利申请号为201910079680.3中的制备方法制备得到的所述细胞载体颗粒聚集体。

本发明还提供了一种细胞培养的方法，包括如下步骤：将所述微载体聚集体采用上述的方法灭菌，然后用于细胞培养，即得到细胞悬液。

上述细胞培养的方法，具体包括如下步骤：1)微载体聚集体准备：采用权利要求1-7中任一项所述的方法将所述微载体聚集体灭菌；

2)接种细胞：在经步骤1)中灭菌的所述微载体聚集体上接种细胞；

3)细胞吸附：将步骤2)中接种细胞进行孵育，使细胞粘附于所述微载体聚集体上；

4)细胞培养：所述细胞粘附后加入完全培养基将所述微载体聚集体分散为微载体，进行细胞培养，即得到所述细胞悬液。

上述细胞培养的方法中，更具体包括如下步骤：a、微载体聚集体准备：采用上述的方法将所述微载体聚集体灭菌；

b、接种细胞：吸取细胞悬液，滴加至每份所述微载体聚集体直至悬液完全吸收；

c、细胞吸附：将混匀细胞悬液的所述微载体聚集体放入37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育2小时，使所述细胞粘附于微载体上；

d、细胞培养：待所述细胞粘附后，加入完全培养基将微载体聚集体充分分散成微载体，放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养96小时，即得到所述细胞悬液。

本发明具体的一个实施例中，所述细胞培养的方法，具体可包括如下步骤：细胞培养方法：

a、微载体聚集体准备：取1份采用上述的方法灭菌的所述微载体聚集体放入非tc6孔板中，待用；

b、接种细胞：吸取200μl密度为2.5×10⁶个细胞/ml的脂肪间充质干细胞悬液，均匀滴加至每份微载体聚集体直至悬液完全吸收；

c、细胞吸附：将混匀细胞悬液的微载体放入37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育2小时，使细胞粘附于微载体上；

d、细胞培养：待细胞粘附后，加入8ml完全培养基将微载体聚集体充分分散成微载体，放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养96小时后进行计数；

e、计数：将生长有脂肪间充质干细胞的微载体从孔中转移到离心管中，离心400×g，2分钟，吸尽上清，加入3ml3dflotrixdigest裂解液(商购于北京华龛生物科技有限公司，r001)，放入37℃的细胞培养箱中孵育30min将微载体完全裂解后获得细胞悬液，取50μl细胞悬液与台盼蓝混匀后使用计数板计数并计算活性。

本发明具有以下优点：

1、为达到无菌并保留吸水分散特性和细胞培养效果所选取的射线种类及对应剂量进行辐照灭菌。

2、辐照灭菌前，为保留吸水分散特性，而对微载体聚集体中微载体颗粒的密度及厚度控制。

3、辐照灭菌前，为保留细胞培养效果，对微载体聚集体的包装方式的改变。

4、聚集体辐照灭菌后具有吸水分散，细胞培养效果良好，无菌。

5、辐照灭菌后，并无有害物质残留。

附图说明

图1为本发明实施例1中采用的微载体聚集体的图片。

图2为本发明10kgy辐照后的微载片放入水中散成独立颗粒在显微镜下观察的图片。

图3为本发明15kgy辐照后的微载片放入水中散成独立颗粒在显微镜下观察的图片。

图4为本发明20kgy辐照后的微载片放入水中散成独立颗粒在显微镜下观察的图片。

图5为本发明实施例1中细胞培养的增殖倍数的柱状对比图。

图6为本发明实施例1中细胞培养的活率的柱状对比图。

图7为本发明实施例2中1mm厚度的聚集体辐照后，放入水中仍不分散的效果图。

图8为本发明实施例2中1.7mm厚度的聚集体辐照后，放入水中分散成单颗粒在显微镜下观察的图片。

图9为本发明实施例2中2mm厚度的聚集体辐照后，放入水中分散成单颗粒在显微镜下观察的图片。

图10为本发明实施例3中钴源的γ射线辐照灭菌的聚集体后，放入水中分散成单颗粒在显微镜下观察的图片。

图11为本发明实施例3中电子加速器的β射线辐照灭菌的聚集体后，放入水中分散成单颗粒在显微镜下观察的图片。

图12为本发明实施例3中细胞培养的增殖倍数的柱状对比图。

图13为本发明实施例3中细胞培养的活率的柱状对比图。

图14为本发明实施例4中瓶子盖好后使用真空密封包装形式辐照灭菌的聚集体后，放入水中分散成单颗粒在显微镜下观察的图片。

图15为本发明实施例4中瓶内充氮气后使用真空密封包装形式辐照灭菌的聚集体后，放入水中分散成单颗粒在显微镜下观察的图片。

图16为本发明实施例4中细胞培养增殖倍数的柱状对比图。

图17为本发明实施例4中细胞培养活率的柱状对比图。

图18为微载体聚集体经高压灭菌后放入水中分散观察的图片。

图19为微载体聚集体经干热灭菌后放入水中分散观察的图片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中细胞为脂肪间充质干细胞；

微载体聚集体为按照专利申请号为201910079680.3中实施例1制备方法制备得到的胞载体颗粒聚集体；

辐照灭菌服务由天津金鹏源辐照技术有限公司(钴源γ射线)和天津蓝孚高能物理技术有限公司(电子加速器β射线)提供。

实施例1、不同辐照剂量影响分散性和细胞培养效果

操作方法：将同一厚度(2mm)微载体聚集体(共含75000颗粒，微载体聚集体体积为100mm³，即微载体聚集体中微载体颗粒的密度为750个/mm³)，如图1所示。取等量四组样品分装于聚乙烯瓶内，瓶子盖好后使用真空袋真空密封包装部分样品进行环氧乙烷灭菌，其余样品分别采用10kgy、15kgy、20kgy进行钴源的γ射线辐照灭菌。分别检验样品的吸水分散能力及细胞培养效果。

吸水分散能力实验：将微载体聚集体置于装有适量水的圆皿中，微载体聚集体吸水膨胀，振荡后，微载体聚集体崩解分散成微粒漂浮于水中，无较大团块即为可以吸水分散。

细胞培养的方法，具体可包括如下步骤：a、微载体聚集体准备：取1份采用上述的方法灭菌的所述微载体聚集体放入非tc6孔板中，待用；

b、接种细胞：吸取200μl密度为2.5×10⁶个细胞/ml的脂肪间充质干细胞悬液，均匀滴加至每份微载体聚集体直至悬液完全吸收；

c、细胞吸附：将混匀细胞悬液的微载体放入37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育2小时，使细胞粘附于微载体上；

d、细胞培养：待细胞粘附后，加入8ml完全培养基将微载体聚集体充分分散成微载体，放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养96小时后进行计数；

e、计数：将生长有脂肪间充质干细胞的微载体从孔中转移到离心管中，离心400×g，2分钟，吸尽上清，加入3ml3dflotrixdigest裂解液(商购于北京华龛生物科技有限公司，r001)，放入37℃的细胞培养箱中孵育30min将微载体完全裂解后获得细胞悬液，取50μl细胞悬液与台盼蓝混匀后使用计数板计数并计算活性。

实验结果与分析：

如图2-4所示，经上述不同剂量辐照灭菌后，微载体聚集体仍可分散。

如图5所示，不同剂量辐照灭菌后，环氧乙烷对照组细胞增殖倍数为5.57倍，10kgy组增殖倍数为4.97，明显低于环氧乙烷组。15kgy及20kgy辐照组，细胞增殖倍数分别为5.71、5.69较接近。四组样品细胞活率均在95％以上。

综合实验数据可知，15～20kgy剂量可以达到分散效果同时对细胞培养效果较佳。

实施例2、不同微载体聚集体厚度影响分散性

操作方法：1mm，1.7mm，2mm不同厚度的微载体聚集体(每个聚集体含130000颗粒，微载体聚集体体积分别为50、85、100mm³，即微载体聚集体中微载体颗粒的密度分别为2600、1529、1300个/mm³)，将同一厚度微载体聚集体分装于多个聚乙烯瓶内，使用真空袋密封包装。2mm厚度的聚集体用环氧乙烷灭菌作为对照组；1mm、1.7mm和2mm厚度的聚集体用20kgy剂量进行钴源的γ射线辐照灭菌作为实验组。灭菌结束后分别检验样品的吸水分散能力。按照本发明实施例1中吸水分散能力实验测定。

实验结果与分析：

如图7-9所示，不同厚度样品辐照灭菌后，1mm厚度不可分散，1.7mm、2mm厚度可以分散。

实施例3、不同辐照源不影响分散性和细胞培养效果

操作方法：将2mm厚度(每个聚集体含100000颗粒，微载体聚集体体积分别为100mm³，即微载体聚集体中微载体颗粒的密度为1000个/mm³)的微载体聚集体分装于多个聚乙烯瓶内，使用真空袋密封包装。样品进行环氧乙烷灭菌作为对比，实验组2mm厚度的微载体聚集体采用20kgy进行钴源的γ射线和电子加速器的β射线辐照灭菌。按照本发明实施例1中吸水分散能力实验和细胞培养的方法分别检验样品的吸水分散能力及细胞培养效果。

实验结果与分析：

由图10～11可知，上述样品使用同一剂量但不同辐照源灭菌后，均可以分散。

由图12～13可知，本发明样品使用同一剂量但不同辐照源灭菌后，环氧乙烷对照组增殖倍数为6.38，β射线辐照后增殖倍数为5.38与γ射线的增殖倍数5.43较接近。三组实验细胞活率均在97％以上。上述结果证明，本发明同一厚度，相同剂量情况下，不同辐照源对分散及细胞培养效果影响不大，均能达到较好的效果。

实施例4、不同包装形式影响分散性和细胞培养效果

操作方法：将2mm厚度(每个聚集体含100000颗粒，微载体聚集体体积分别为100mm³，即微载体聚集体中微载体颗粒的密度为1000个/mm³)微载体聚集体分装于多个聚乙烯瓶内，分别采用瓶子盖好后使用真空密封包装，瓶内充氮气后使用真空密封包装两种方式进行包装。样品进行环氧乙烷灭菌，同时采用20kgy钴源的γ射线辐照灭菌。分别检验样品的吸水分散能力及细胞培养效果。

实验结果与分析：

由图14-15可知，不同包装形式辐照灭菌后，均可以分散。

由图16～17可知，不同包装形式辐照灭菌后，环氧乙烷对照组增殖倍数为6.88。真空包装组增殖倍数为5.15，远低于对照组。充氮后真空包装增殖倍数为6.17。细胞活率对照组及充氮后真空包装组均为95％以上，高于真空包装组的88.36％。综合上述实验结果可知，本发明优选充氮后真空包装可达到分散效果及细胞培养效果受到最小影响。

对比例1、

高压灭菌：将2mm厚度的微载体聚集体(每个聚集体含100000颗粒，微载体聚集体体积分别为100mm³，即微载体聚集体中微载体颗粒的密度为1000个/mm³)放入耐高温聚丙烯瓶内，瓶盖微松，以确保不产生瓶子因高压而爆炸，放入高压灭菌锅进行121℃，20分钟高压灭菌后，60℃烘箱烘干12小时。

如图18中结果可知，细胞微载体聚集体不能实现吸水分散，可能因细胞微载体聚集体中颗粒之间因分子在高压和有水汽的条件下发生的化学反应，导致相互交联，导致难以实现吸水分散。

对比例2、

干热灭菌：将2mm厚度的微载体聚集体(每个聚集体含100000颗粒，微载体聚集体体积分别为100mm³，即微载体聚集体中微载体颗粒的密度为1000个/mm³)放入玻璃瓶内，瓶口用锡纸包紧，放入电烘箱内加热至170℃，2小时。

如图19中结果可知，细胞微载体聚集体不能实现吸水分散，可能因细胞微载体聚集体中颗粒之间因分子在高温条件下发生的化学反应，导致相互交联，导致难以实现吸水分散。