一种3D微生物打印体及其制备方法和应用

一种3d微生物打印体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于三维生物打印技术领域，具体涉及一种3d微生物打印体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.3d生物打印，也称为生物添加制造，已被公认为一种新型生物材料制备方法，主要应用及发展于组织工程、生物医学等领域，基于这些领域中3d生物打印技术的成熟研究成果，结合细菌的强大生化机制，创造具有可控3d形状、微观结构和动态代谢反应的“微生物材料”是值得探索的研究方向。
3.目前的研究表明，在生物修复技术中，存在许多具有协同作用的微生物，通过释放信号分子等方式实现促进功能菌群生长及提升活性等作用。但一般所使用的协作菌种实际上在一定程度上存在竞争关系，在同一空间下会存在争夺底物的问题，因此群体感应在实际应用中存在限制，需要对其进行技术改良，将协作菌种固定在不同的隔间中可以实现在弱化乃至规避种间竞争的同时实现高效协同生物修复的目的，而3d生物打印技术的梯度打印特性为突破这一问题提供了可能性。
4.在生物打印技术中，需要突破的最关键问题是打印墨水的提质增效，而微生物3d打印，特别是用于复杂环境污染处理的3d打印生物活性材料，对打印墨水的机械性能和生物适应性提出了高要求。当应用单组分水凝胶时，单一结构很难同时具有3d打印过程所需的物化性质和包埋生物体所需的生化性质，因此需要探究具备高生物亲和性及高机械性能的多组分打印墨水。
5.目前有关3d微生物材料的研究十分匮乏，在污染处理领域存在空白。因此，开发一种以高功能性双网络打印墨水为基础的3d群体感应功能微生物打印体具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供一种双网络生物打印墨水的制备方法，采用本发明提供的双网络生物打印墨水进行3d生物打印所构建的3d微生物打印体具有较好的物理性质及优秀的生物活性，在环境污染处理的生物工艺领域具有较好的应用前景。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种3d微生物打印体的制备方法，包括以下步骤：
9.步骤1：使用海藻酸钠、明胶、功能菌群菌液和水混合得到第一打印墨水，打印一层x向打印层，x向打印层的打印角度为0
°
；
10.步骤2：使用海藻酸钠、明胶、协同菌群菌液和水混合得到第二打印墨水，在所述x向打印层上表面打印一层y向打印层，y向打印层的打印角度为90
°
；
11.步骤3：使用所述第一打印墨水在所述y向打印层的上表面打印一层所述x向打印层；
12.步骤4：使用所述第二打印墨水在所述x向打印层打印一层所述y向打印层；
13.步骤5：依次重复所述步骤3与所述步骤4，直至打印出具有3d结构的3d微生物打印体。
14.优选的，在所述第一打印墨水中，所述海藻酸钠、所述明胶、所述功能菌群菌液与所述水的质量比为2:(4-8):(10-20):100。
15.优选的，所述功能菌群包括从活性污泥、垃圾渗滤液或土壤中提取出的脱氮细菌、除磷细菌等功能菌种的一种或多种。
16.优选的，在所述第二打印墨水中，所述海藻酸钠、所述明胶、所述协同菌群菌液与所述水的质量比为2:(4-8):(10-20):100。
17.优选的，所述协同菌群包括可以释放促进所述功能菌群生长与生物活性的协同菌种的一种或多种。
18.优选的，所述第一打印墨水及第二打印墨水的打印压力为10-500kpa，打印速度为3-6mm/s，打印喷嘴直径为0.41mm，挤出头温度0-37℃，打印台温度0-37℃。
19.优选的，将得到的所述第一打印墨水及第二打印墨水置于低温环境下进行预交联，再将完成预交联及打印过程的所述3d微生物打印体置于交联溶液中进行后交联。
20.优选的，所述低温环境的温度范围在-20℃-4℃，所述交联溶液为氯化钙溶液。
21.优选的，所述氯化钙溶液的质量分数为2％。
22.本发明的目的之二在于提供一种3d微生物打印体，由上述的制备方法制得。
23.本发明的目的之三在于提供一种3d微生物打印体的应用，由上述的制备方法制得的3d微生物打印体应用于环境污染处理。
24.本发明相比于现有技术，至少具有如下有益效果：
25.(1)本发明的生物打印墨水以海藻酸钠为基质，通过具有温敏性质的明胶的引入以及其含量的优化选择两方面来增强打印墨水的粘度，使3d微生物打印体在打印后交联前能够以稳定状态保持结构，提升了打印体的挤出成型能力，在后交联后同时具备明胶网络的刚性及海藻酸钠网络的韧性，大幅提高打印体的机械性能；
26.(2)本发明的3d微生物打印体中将功能菌群及协同菌群分布在不同的打印层中，一定程度上弱化乃至完全避免了二者之间的种间竞争，使其效率达到最大化；
27.(3)由于3d打印设计的复杂结构及配置的特异性墨水结构，3d微生物打印体具有良好的传质效果，协同菌群打印层所释放的信号分子可以以极快的速度传递至功能菌群打印层内，同时功能菌群与外部环境也具有优秀的物质交换速率，使其可以高效完成协同生物修复过程；
28.(4)本发明中使用的海藻酸钠及明胶均为天然聚合物水凝胶，具有很好的生物相容性，可以在提高成型后包裹微生物的活性的同时保护微生物不受外界极端条件的影响，且不会破坏生物修复的处理环境。
附图说明
29.图1是本技术对比例1的成型性情况。
30.图2是本技术对比例1在光学显微镜下的宏观结构。
31.图3是本技术对比例1的表面及截面微观形貌。
32.图4是本技术对比例2的表面及截面微观形貌。
33.图5是本技术对比例2的细菌死活荧光图像。
具体实施方式
34.为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例1
36.一种3d打印体的制备方法，包括以下步骤：
37.(1)配置海藻酸钠溶液：精确称取2g海藻酸钠，取超纯水50ml在烧杯中共混后移至恒温水浴锅，设置温度为70℃水浴搅拌1.5h，使其完全溶解后，静置30min消除气泡待用；
38.(2)配置明胶溶液：精确称取4g明胶颗粒，取超纯水50ml在烧杯中共混后移至恒温水浴锅，设置温度为40℃水浴搅拌0.5h，使其完全溶解后，静置30min消除气泡待用；
39.(3)配置双网络打印墨水：将配置好的海藻酸钠与明胶溶液在烧杯中共混后移至恒温水浴锅，设置温度为37℃水浴搅拌1.5h，使其完全溶解后，静置30min消除气泡待用；
40.(4)预交联：将打印针头(直径0.41mm，塑料针头)安装在打印针筒(10cc)上，并将双网络打印墨水分别加载两个打印针筒中，针尖朝下静置30min除去气泡后移至冰箱中4℃储存24h以上待用；
41.(5)3d打印：将两个打印针筒分别安装在气动挤出式生物打印机的双通道中进行交替分层打印，打印尺寸20mm*20mm*4mm，并调整打印参数为：打印间隔4mm，层高0.4mm，打印速度4mm/s，挤出头温度25℃，打印台温度25℃，挤出气压30-50kpa，第一通道打印角度为0
°
，第二通道打印角度为90
°
；
42.(6)后交联：将打印产物浸泡于2％氯化钙溶液中交联6h，得到3d打印体。
43.实施例2
44.一种3d微生物打印体的制备方法，包括以下步骤：
45.(1)配置海藻酸钠溶液及明胶溶液方法同实施例1；
46.(2)配置第一打印墨水方法同实施例1，并加入预设量的功能菌群菌液，菌液占墨水比例的20％；
47.(3)配置第二打印墨水方法同实施例1，并加入预设量的协同菌群菌液，菌液占墨水比例的20％
48.(4)预交联、3d打印及后交联方法同实施例1。
49.在第一打印墨水中，功能菌群包括但不限于由从活性污泥、垃圾渗滤液、土壤中提取出的脱氮细菌、除磷细菌等功能菌种的一种或多种。
50.在第二打印墨水中，协同菌群包括但不限于可以释放促进所述功能菌群生长与生物活性的协同菌种的一种或多种。
51.对比例1
52.配置明胶溶液的方法在实施例1的基础上将加入的明胶质量设置为1g、2g、4g、6g、8g，对应3d打印方式中挤出气压设置为0-10kpa、0-30kpa、30-50kpa、80-100kpa、180-200kpa，其余步骤同实施例1。
53.由于海藻酸钠需要在挤出后进行钙交联才能获得稳固的凝胶结构，因此明胶体系的存在及低温预交联使墨水可以具有一定的流变特性，使其能够顺利挤出并成型。本发明通过配置上述不同明胶浓度的双网络打印墨水，对比获得了墨水材料性能分析结果。
54.成型性分析结果如图1所示，不同的明胶浓度会使打印过程及打印体成型情况出现差异。当明胶浓度过低时(w/v＝1％、2％)，打印墨水结构过于松散，接近液态，使打印过程无法顺利成型；明胶浓度适中时(w/v＝2％、4％)，打印墨水流变性能良好，既可以顺利挤出，同时具备成型稳定性；当明胶浓度过高时(w/v＝8％)，由于过度成胶导致墨水形状更接近固态，虽然可以打印成型，但无法做到顺畅挤出。
55.图2、图3所示为对比例中可以成型的三组打印体在光学显微镜下的宏观结构及扫描电子显微镜下的微观结构对比图。由图中可以明显发现，显微镜下明胶浓度为4％时的宏观结构明显更加清晰光滑，后两组出现气泡及空缺的情况随着明胶含量升高愈发严重，分辨率下降，和打印过程中墨水成型情况的对比相符。可以得到，由于高浓度明胶导致的过度交联会使打印过程存在偏差及不规则堆叠，从而使内部结构不规律松散，大大降低了其成型性能。
56.因此从墨水性能方面综合评价后得到的最佳墨水组成，即明胶浓度为4％的墨水体系作为本发明的双网络生物墨水组成。
57.对比例2
58.配置第一打印墨水及第二打印墨水的方法在实施例2的基础上将加入的菌液比例设置为0％、10％、20％、30％，其余步骤同实施例2。
59.经打印验证，当菌液浓度大于20％时，打印墨水由于稀释作用会丧失部分粘度及机械强度，导致无法顺利挤出成型，将菌液浓度为0％、10％、20％的墨水顺利打印成型后，为探究3d微生物打印体微观结构及打印体内部微生物生长情况，使用扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜对其进行观察。
60.图4为制备的0％/10％/20％菌液浓度3d微生物打印体的表面及截面微观结构。结果表明，0％组在表面及截面上均是光滑的，而负载了微生物的3d打印体均可以在表面及截面观察到细菌的部分结构，形态为镶嵌在打印体的截面及表面上，分布均匀且密度较大，随着负载菌液浓度的上升，显示固定在打印体中的菌群密度也随之上升，证实了其对菌群的成功固定。
61.图5为制备的0％/10％/20％菌液浓度3d微生物打印体的细菌死活荧光图像。从图像上可以明显看出，在打印体形成初期，10％菌液浓度和20％菌液浓度的3d微生物打印体均体现出非常强的绿色荧光强度(成活细胞)和非常微弱的红色荧光强度(凋亡细胞)，而4％gel组则几乎不表现荧光，直接证明了在打印体实现了菌群的成功负载且保持了极高的生物活性，根据死活细胞比分析结果可知活细胞比例均占到90％以上；为了验证3d微生物打印体对微生物活性的保护以及在冷藏条件下的微生物打印体的保存情况，将打印体在4℃条件下冷藏，在第10天及第20天观察打印体的荧光图像，从图像中可以看出在没有为微生物打印体提供所需营养物质的情况下，材料内部依然体现了一定的生物活性，但随着时间推移，红色荧光强度逐渐升高，表明在第10天已经出现了凋亡情况，且凋亡细胞已经占到了总细菌的30％以上，而在第20天可以看到整体的荧光强度都有所下降，导致这一现象的原因可能是在长时间冻存的条件下细菌细胞壁出现裂解，进而导致细菌rna遭到破坏，使pi
无法顺利进行核酸染色。而图中出现的绿色荧光表明虽然在这个阶段细菌出现大量凋亡，但仍有一定数量的活菌生存，一定程度上证明了3d微生物打印体对其生物活性的良好保持作用。
62.根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。