一种微生物3D打印的标准化传感元件及其制备方法和应用

本发明涉及环境监测，具体涉及一种微生物3d打印的标准化传感元件及其制备方法和应用。

背景技术：

1、水环境污染控制和水生态保护是我国生态文明建设的重要组成部分，而水环境监测是实现上述目的的基础与保障。生化需氧量(bod)作为地表水质安全的重要指标和表征污水可生化性的关键参数，指的是好氧微生物分解水中可生物降解有机物过程中消耗的溶解氧的数量，反映的是水体中可被微生物利用的有机污染物的含量。因此，bod值的实时精确反馈对地表水环境污染的早期预警，以及污水生物处理过程的科学调控具有重要意义。

2、近年来，以微生物燃料电池(mfc)为基础的传感器的快速发展为水环境bod的实时在线监测带来了可能性。mfc型bod生物传感器的原理是利用阳极电活性生物膜(eab)从可生物降解的有机物中获取电子，并通过外电路形成电流信号以实现bod浓度的监测。阳极eab传感元件是mfc型bod传感系统的核心，其生物活性、电子传输效率和稳定性决定了传感系统的性能。阳极eab通常由水体或沉积物中的微生物驯化而成，但是由于微生物群落的差异，制备的mfc型bod传感系统无法标准化，结果再现性差；在随机定殖的情况下，大量非电活性微生物与电活性微生物竞争，导致mfc型bod传感系统不稳定、启动时间长；同时，由于大多数电活性微生物都是严格厌氧的，因此水环境中的氧气会抑制阳极eab的活性，降低传感器的准确性；此外，阳极eab的低电导率和阳极较差的电子收集能力也制约着电极-微生物界面电子转移速度，使得传感系统响应时间增加。显然，这些都限制了mfc型bod生物传感系统的工程应用。

3、对于上述问题，现有的改进技术多是利用固定化手段制备人工阳极eab、开发微生物电解池传感系统，用于bod传感系统的快速构建与含氧水环境bod浓度检测，但是人工阳极eab易脱落、传质差，且难以精准控制功能微生物的空间分布；而微生物电解池需要外部电源供能、维护复杂，且bod检测范围较小，更适用于实验室规模的水环境bod浓度检测。

4、因此，确有必要开发一种针对改善mfc型bod传感器精确、快速、稳定监测含氧水环境bod浓度的标准化传感元件有效的制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对现有技术的不足，提供一种微生物3d打印的标准化传感元件的制备方法，在促进mfc型bod传感系统的工程化应用的同时提高传感系统的再现性、准确性、稳定性和灵敏度，实现多场景下对bod浓度进行实时监测预警。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种微生物3d打印的标准化传感元件的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤s1、将海藻酸钠、纤维素、耗氧微生物菌液混合得双网络生物墨水ⅰ，将所述双网络生物墨水ⅰ以水平方向打印一层方形底层；

5、步骤s2、将明胶甲基丙烯酸、聚乙二醇二丙烯酸、光引发剂、导电材料和电活性微生物菌液混合得双网络生物墨水ⅱ，将所述双网络生物墨水ⅱ在步骤s1中方形底层上表面中间处以水平、垂直方向交替打印一层方形网状内层；

6、步骤s3、将所述双网络生物墨水ⅰ在所述方形底层上表面、方形网状内层周围以垂直、水平方向交替打印一层环形外层；

7、步骤s4、依次重复上述步骤s2与步骤s3，直至制得3d微生物打印体，在紫外光或可见光下原位交联，以实现内层的快速成型；

8、步骤s5、将所述双网络生物墨水ⅰ在所述3d微生物打印体上表面以垂直方向打印一层方形顶层，制得3d微生物完整打印体；

9、步骤s6、将所述3d微生物完整打印体置于氯化钙溶液中进行交联反应后，制得微生物3d打印的标准化传感元件。

10、优选地，生物墨水合成过程使用的容器和溶液均经过高温高压灭菌，打印过程和交联过程均在超净工作台上进行。

11、优选地，步骤s1中，双网络生物墨水ⅰ中，海藻酸钠、纤维素、耗氧微生物菌液的用量比为(1-2)g:(1-4)g:20ml，耗氧微生物菌液的细胞密度od600值为1-3。

12、优选地，耗氧微生物菌液的制备方法为：将预先培养、离心的耗氧微生物沉淀物重新悬浮在磷酸盐缓冲液中，形成细胞密度od600值为1-3的耗氧微生物菌液。

13、优选地，耗氧微生物为专性好氧微生物，包括大肠杆菌、威尼斯不动杆菌、嗜水气单胞菌等功能菌种的一种或多种，其中，优选为大肠杆菌。

14、优选地，步骤s2中，双网络生物墨水ⅱ中明胶甲基丙烯酸、聚乙二醇二丙烯酸、光引发剂、导电材料和电活性微生物菌液的用量比为(5-15)g:(3-15)g:(0.5-2)g:(2.5-10)g:100ml，电活性微生物菌液的细胞密度od600值为2-4。

15、优选地，光引发剂包括lap光引发剂、偶氮引发剂va-086、ey光引发剂、irgacure2959光引发剂或rf光引发剂中任一种，其中，优选为lap光引发剂。

16、优选地，导电材料包括活性炭粉末、炭黑、石墨烯、碳纳米管、聚吡咯、聚噻吩中的一种或多种。

17、优选地，电活性微生物菌液的制备方法为：将预先培养、离心的电活性微生物沉淀物重新悬浮在磷酸盐缓冲液中，形成细胞密度od600值为2-4的电活性微生物菌液。

18、优选地，电活性微生物为具有胞外电子传递能力的微生物，包括希瓦氏菌、地杆菌、假单胞菌等功能菌种的一种或多种，其中，优选为硫还原地杆菌。

19、优选地，步骤s1中，双网络生物墨水ⅰ的挤出气压为30-60kpa，打印速度为5-8mm/s，打印喷嘴直径为0.58-1.20mm，层厚为0.4-0.7mm，挤出头温度为25-37℃，打印台温度为25-37℃。

20、优选地，步骤s2中，双网络生物墨水ⅱ的挤出气压为10-40kpa，打印速为3-5mm/s，打印喷嘴直径为0.41-0.84mm，层厚为0.4-0.7mm，挤出头温度为20-30℃，打印台温度为20-30℃。

21、优选地，打印过程借助微挤出式双通道生物3d打印机完成。

22、优选地，步骤s1中，方形底层网格间隙为0mm。

23、优选地，步骤s2中，方形网状内层的面积为步骤s1所述方形底层面积的70％，方形网状内层网格间隙为2-4mm。

24、优选地，步骤s3中，环形外层的面积为步骤s1所述方形底层面积的30％，环形外层的网格间隙为0mm。

25、优选地，步骤s5中，方形顶层网格间隙为0mm。优选地，步骤s4中，紫外光波长为250-420nm，可见光波长为400-800nm，原位交联反应时间为10-60s。

26、优选地，步骤s6中，氯化钙溶液的质量分数为2-20％，优选的数值为10％，交联时间为0.5-4h，优选的数值为1h。其中，海藻酸钠与二价阳离子ca2+通过螯合效应进行凝胶化，以形成结构稳定的底层、外层和顶层。

27、优选地，步骤s5中，方形顶层面积与步骤s1所述方形底层面积相同。

28、优选地，步骤s5中，3d微生物完整打印体的长宽高比为(4-8):(4-8):1。

29、优选地，3d微生物完整打印体大小为20mm×20mm×5mm-40mm×40mm×5mm。

30、此外，本发明还提供一种由上述方法制得的微生物3d打印的标准化传感元件。

31、其中，微生物3d打印的标准化传感元件底层、外层和顶层的作用为消耗待测水样中的氧气，保证内层电活性微生物厌氧环境；微生物3d打印的标准化传感元件内层的作用为降解待测水样中的有机物并产生电子。

32、此外，本发明还提供一种上述微生物3d打印的标准化传感元件在环境环境监测中的应用，包括以下步骤：

33、步骤s1、构建双室mfc反应器，包括阳极室、阴极室和阳离子交换膜，其中，阳极为所述微生物3d打印的标准化传感元件；

34、步骤s2、用含乙酸钠的磷酸盐缓冲液填充阳极室，用含铁氰化钾的磷酸盐缓冲液填充阴极室，每个周期更换一次阳极液和阴极液，使用电化学数据采集系统监测每个周期的电压变化，待相邻周期的电压峰值相差小于5％时，视为双室mfc反应器启动成功；

35、步骤s3、将待测含氧有机污水或地表水通入启动成功的双室mfc反应器的阳极室中，利用电化学数据采集系统获得电压-时间曲线，测试完成后将待测水样排出并用磷酸盐缓冲液清洗阳极室和阴极室；

36、步骤s4、根据库伦法bod计算公式计算得水样的bod浓度：

37、

38、

39、式中：q为库伦量，即电子转移总量，c；

40、u为双室mfc反应器的输出电压，mv；

41、r为外电路中的固定电阻值，ω；

42、t为水样检测时间，即电压恢复至起始状态时所需时间，s；

43、f为法拉第常数，96485c/mol；

44、v阳极为阳极室的有效体积；

45、0.8为内层电活性微生物利用的有机物占水样中总有机物的比例，经验值。

46、优选地，步骤s1中，双室mfc反应器体积为28-100ml，优选的数值为28ml；阳极室和阴极室的体积相等，阳极与阴极相对且面积相等。

47、优选地，步骤s1中，阳极为微生物3d打印的标准化传感元件，阴极为铂片、石墨毡、不锈钢网等常规电极中的一种，阳极与阴极通过外电路连接，外电路中连接有固定电阻，外接电路的固定电阻为10-1000ω。

48、优选地，步骤s1中，双室mfc反应器在20-30℃下运行。

49、优选地，步骤s2中，含乙酸钠的磷酸盐缓冲液ph值为7.0-7.5，溶解氧为5-6mg/l，乙酸钠的浓度为500-1000mg/l，磷酸盐缓冲液浓度为50-100mm。

50、优选地，步骤s2中，每个周期时长为12-24h。双室mfc反应器的启动时间小于48h。

51、优选地，步骤s3中，待测有机污水/地表水的有机物浓度为20mg/l＜bod5＜300mg/l，且不含生物毒性物质。有机污水/地表水的单次检测时间小于1h。

52、优选地，bodq与国标bod5的测试结果误差<10％。

53、相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

54、1)本发明利用微生物3d打印技术精准控制传感元件的大小、形状以及功能细菌(电活性微生物)与协同细菌(耗氧微生物)的种类、丰度，制备了标准化传感元件，可推广性强。将导电材料、电活性微生物混合打印，突破了电极-微生物界面电子传递的限制，促进了高效电子传递。此外，将功能细菌及协同细菌分布在不同的打印层中，不仅降低甚至避免了二者之间的种间竞争，且外层的耗氧微生物能消耗水样中的氧气进而为内层电活性微生物创造厌氧环境，使bod传感效率达到最大化。

55、2)本发明中使用的生物墨水材料具有良好的生物相容性和力学特性，可在保证微生物活性的同时为微生物的生长、繁殖、代谢创造适宜的三维微环境。其中，内层打印双网络生物墨水ⅱ以明胶甲基丙烯酸、聚乙二醇二丙烯酸为基质，改善了生物墨水的流变性与力学特性，使3d微生物打印体在打印后能够维持稳定结构，进而通过添加光引发剂实现紫外光/可见光下3d微生物打印体的原位交联，有效提高了打印体的机械性能。而外层打印双网络生物墨水ⅰ中的纤维素具有高粘度，其共混海藻酸钠也可保证制备的三维结构的机械强度，同时借助钙交联可进一步强化3d微生物打印体的结构稳定性。

56、3)本发明基于制备的微生物3d打印的标准化传感元件提供了一种适用于有机物浓度为20mg/l＜bod5＜300mg/l的不含生物毒性物质的含氧有机污水/地表水的快速检测方法，单次检测时间小于1h，与国标bod5的测试结果误差<10％。它克服了传统mfc型bod传感系统再现性差、启动困难、响应时间长、适用场景少的缺陷；将mfc型bod传感系统的应用范围扩展到含氧水环境，可对河水、湖水、污水处理厂进、出水等多场景的bod进行原位实时监测预警；还具备检测过程快速、检测结果准确、再现性好等优点，这将推动mfc型bod生物传感系统的工程应用。