本发明涉及生物环境修复技术领域，具体而言，涉及利用超富集植物接种枯草芽孢杆菌修复cu、pb、as污染的方法。
背景技术：
工业发展带来了经济的腾飞，也带来了严重的污染。由于现阶段我国简单粗放的生产方式使大量种类复杂而又毒性极强的污染物如重金属（cu、pb、as等）等进入环境，形成了严重的复合污染。这些污染，尤其是重金属污染可以通过食物链，对动植物以及人类自己造成危害，生活在这种环境下的居民也存在严重的健康风险。
cu、pb、as等污染是工业生产中常见的污染元素，但现阶段国内外针对于cu、pb、as污染土壤修复的研究仍处于较初级的阶段，常用技术大致可分为物理、化学和生物等三种，由于现实中污染情况的复杂性，很难做到较全面的修复。化学与物理修复对土壤性质破坏较大，只适用于污染不严重的土壤，其投资与运行成本过高，且易造成二次污染。生物修复对土壤性质基本无破坏，可以适应更高浓度的污染环，其风险也更小，耗费低、对土壤扰动小。生物修复技术包括植物富集、微生物修复等技术。微生物修复技术是针对有机物污染修复中常见的一种修复技术。植物修复技术是重金属污染修复中常见的一种修复技术。采用植物修复技术修复cu、pb、as污染土壤具有不错的效果，但在投入量产和使用的过程中存在很多问题，比如植物生长缓慢，抗逆性差，不能耐受cu、pb、as超标土壤，需要因地制宜等。目前发现蓖麻具有较强的抗逆性，可以正常生长于cu、pb、as超标土壤中，但其单独种植对这些元素的吸附能力有限，cu、pb、as的毒性对蓖麻生长具有抑制性，所以单一的修复技术难以达到预期的效果。
技术实现要素：
针对以上缺陷，本发明提供了一种植物—微生物联合修复cu、pb、as污染土壤的方法，所用微生物为枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌可以辅助植物修复污染土壤，其代谢过程可改变根际土壤重金属的生物有效性，从而有利于超积累植物对cu、pb、as的吸收和积累，代谢产物还可改善土壤生态环境。另外，枯草芽孢杆菌能够分泌植物激素类物质、铁载体等活性物质，促进植物的生长。反之，植物根系分泌氨基酸、糖类、有机酸及可溶性有机质等被枯草芽孢杆菌代谢利用，促进其生长，有利于提高联合修复cu、pb、as污染的效率。
本发明中所用到的枯草芽孢杆菌，拉丁名：bacillussubtilis，编号：cmcc-63501。该材料及其他原料均可从中国医学细菌保藏管理中心或其他市场中购买到，其规格符合国家行业标准。具体方法步骤如下：
利用向日葵、蓖麻接种枯草芽孢杆菌修复cu、pb、as污染土壤的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌悬液制备：将枯草芽孢杆菌转接到lb液体培养基中，在（29±1）℃下摇床培养24h后，在冷冻离心机上8000r/min离心10min，弃上清液，用灭菌的磷酸盐缓冲液冲洗菌体两次，最后将菌体溶解在无菌水中，即为备用的菌悬液；
（2）种子接菌：选取饱满的蓖麻和向日葵种子，先用1%的naclo浸泡20min表面消毒，再用无菌水冲洗后将其置于浓度为109cfu/ml菌悬液中包衣30min；
（3）土壤预处理：对待修复的土壤翻整，浇水，施肥；
（4）栽培：待上述包衣的蓖麻种子和向日葵种子阴干后，播种在污染土壤中，两种植物实行混种，株距0.5~1.0m；
（5）管理：当苗高10cm时进行间苗，拔除生长过密的细弱幼苗，并结合中耕除草一次，在苗高17~20cm时即可定苗，并进行第二次中耕除草，在开花前可进行第三次中耕除草，当苗高30cm时，结合中耕进行培土壅蔸，固定根部；
（6）移除及后续处理：一段时间后移除所有蓖麻与向日葵，对移除的植株进行无公害处理，提取其中的cu、pb、as元素。
进一步地，所述步骤（1）中lb液体培养基的组成为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl5g/l，用naoh调整ph为7。
进一步地，所述步骤（4）中蓖麻种子和向日葵种子先在温度为25℃、相对湿度为65%的沙土中萌发，待幼苗出土长出3~4片真叶时，带泥移栽到污染土壤中，移栽后每隔3~5天浇水一次，到成活为止。
进一步地，所述步骤（2）菌悬液中添加有新高脂膜、磷酸二氢钾、尿素混合溶液。
进一步地，所述步骤（4）中蓖麻和向日葵在污染土壤中混种，同种植株间隔种植，向日葵和蓖麻间距0.5~1.0m。
进一步地，所述步骤（5）管理过程中蓖麻定期施加氮肥，开花后改施磷肥。
进一步地，所述步骤（6）还包括在移除前两周在土壤里施加螯合剂。
进一步地，当cu、pb、as浓度超过一定阈值时，在所述修复方法前还需对污染土壤进行淋洗预处理。
向日葵根系发达，在土壤中分布广而深，其中60%左右的根系分布在0～40厘米土层中，但其单独种植在cu、pb、as超标土壤中生长迟缓，接菌后增强了对重金属耐受性，表现为强抗逆性，可以正常生长在超标土壤中。蓖麻同样具有较强抗逆性，可以直接生长于污染土壤中。向日葵地上部分较蓖麻矮小，地下根系却更丰富，施行混种，即一株向日葵一株蓖麻，这样向日葵地下根系可以连结在一起，再结合蓖麻根系可以做到根高密度覆盖污染土壤，地上植株高低错落，充分利用光能，合理配置作物群体，充分发挥边行优势的增产作用，经试验，两种植物套种比单种一种植物的生物量增加了11%。
本方法采用科学管理手段，针对性的管理，在土壤预处理中进行浇水，据研究，向日葵在水环境中对重金属，尤其是pb的富集高达91mg/g；蓖麻的吸肥力强，前期需要氮肥多，开花后以施磷钾肥为主而采用专门的施肥措施；根据苗生长不同阶段采取不同的管理手段，当苗高达到30cm时，结合中耕进行培土壅蔸，固定根部，防风防倒伏。
在修复过程中，cu、pb、as毒性会对植物的生长产生影响，进而影响植物根部吸收cu、pb、as离子的通道，在低浓度时植物通过酶活性的调控，依然可以保持对cu、pb、as的吸收，但当cu、pb、as浓度超过一定阈值时，可能导致植物毒害甚至死亡，直接抑制植物根部对cu、pb、as的富集。因此，当cu、pb、as浓度超过一定阈值时，在所述修复方法前还需对污染土壤进行淋洗预处理。经试验，对于向日葵与蓖麻来说，当出现cu浓度超过800mg/kg，pb浓度超过1600mg/kg，as浓度超过400mg/kg情况之一时，其修复效率受影响较大，此时需要在所述修复方法前对污染土壤进行淋洗预处理来降低cu、pb、as浓度。
本发明的原理是利用蓖麻与向日葵生长过程中，土壤中的cu、pb、as逐步转移至蓖麻与向日葵植株体内，然后通过将富集了cu、pb、as的植株整体从土壤中移除，最终实现土壤中超标cu、pb、as的去除。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）枯草芽孢杆菌会促进植物生长，尤其是蓖麻地上部分与向日葵根系的生长，这样根系可以更好地覆盖地下部分，结合间隔种植，蓖麻和向日葵可以充分利用光能，发挥更好地效用；接菌还有利于蓖麻与向日葵对土壤中cu、pb、as的富集，分泌多种酶和抗生素，使植物可以更好地在cu、pb、as超标的土壤中生长；
（2）蓖麻与向日葵在修复cu、pb、as复合污染方面有着良好的效果，尤其是对cu、pb、as等金属类金属的吸收能力很强，且不会造成二次污染；
（3）蓖麻与向日葵对不同金属元素的吸收具有差异性，间作套种可以更加全面的吸收cu、pb、as污染；
（4）枯草芽孢杆菌可以改变土壤中cu、pb、as的存在形式，增加cu、pb、as有效态的含量，使得蓖麻与向日葵根系对其更易吸收；
（5）向日葵单独种植在cu、pb、as超标土壤中生长迟缓，接菌后增强了对cu、pb、as耐受性，表现为强抗逆性，可以正常生长在超标土壤中。蓖麻同样具有较强抗逆性，其与向日葵混合种植能够合理配置作物群体，地下根高密度覆盖污染土壤，地上高低错置，充分发挥边行优势的作用；
（6）采用科学管理手段，针对性的管理，前期营造水环境，有助于植株生长，也有助于对重金属吸收；蓖麻的吸肥力强，前期需要氮肥多，开花后以施磷钾肥为主而采用专门的施肥措施；根据苗生长不同阶段采取不同的管理手段，当苗高达到30cm时，结合中耕进行培土壅蔸，固定根部，防风防倒伏；
（7）菌悬液中添加有新高脂膜、磷酸二氢钾、尿素混合溶液能驱避地下病虫，隔离病毒感染，不影响萌发吸胀功能，加强呼吸强度，提高种子发芽率，为种子和枯草芽孢杆菌生长或繁殖提供初期营养；添加化学螯合剂使蓖麻、向日葵与cu、pb、as配位，增加cu、pb、as的生物有效性，提高作物对cu、pb、as的富集能力，进一步促进了植物提取效率；
（8）淋洗与生物修复结合，可以单独或组合处理不同浓度的cu、pb、as污染；
（9）本方法对cu、pb、as去除率高，可以规模化使用，适用性更广，易于推广，便于实施。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合相关实施例对本发明进行更清楚、全面地描述。利用向日葵、蓖麻接种枯草芽孢杆菌修复cu、pb、as污染土壤的方法可以以许多不同的形式实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些具体实施例的目的是使本发明的内容更加透彻全面。
本发明所用枯草芽孢杆菌可以从市场购得，实施方式中所用微生物菌株自郑州精思威化工有限公司购置进行培养驯化，菌种及培养条件如表1所示。
表1枯草芽孢杆菌培养条件及编号
首先将购置的菌株进行打管复活：①用75%酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将管顶端于酒精灯外焰上均匀加热；②立即滴2-3滴无菌水于加热部位，使管壁破裂；③用镊子敲下破裂处；④用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基（固体培养基去掉琼脂即可）于冻干管中将冻干菌粉全部溶解；⑤将溶解后的菌悬液转移至4-5ml液体培养基的试管中混匀，并取100μl转接到固体培养基上；⑥将液体试管和斜面试管于推荐条件下静置培养。
然后对复活的菌株采用平板划线法分离纯化，再将分离纯化的菌株转接到含不同浓度cu、pb、as的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中斜面培养观察，以耐受cu、pb、as浓度高的菌株为筛选依据，试验结果显示枯草芽孢杆菌对cu、pb、as具有很强的耐性。
在土培试验前，还进行了预试验，以便确定土壤菌落环境对枯草芽孢杆菌的影响。取两份试验土样，一份土样经灭菌锅灭菌处理，另一份土样不做处理。两份土样同时加入等量枯草芽孢杆菌菌悬液。处理30d后，对土样中的菌株进行检测。试验发现，两份土样菌株存活量几乎相同。这表明土壤菌落环境对试验所选枯草芽孢杆菌没有影响，这便于后续微生物/植物联合修复试验的扩大研究。
利用向日葵、蓖麻接种枯草芽孢杆菌修复cu、pb、as污染土壤的方法，具体按照如下步骤进行：
（1）菌悬液制备：将枯草芽孢杆菌转接到lb液体培养基中，在（29±1）℃下摇床培养24h后，在冷冻离心机上8000r/min离心10min，弃上清液，用灭菌的磷酸盐缓冲液冲洗菌体两次，最后将菌体溶解在无菌水中，即为备用的菌悬液；
（2）种子接菌：选取饱满的蓖麻和向日葵种子，先用1%的naclo浸泡20min表面消毒，再用无菌水冲洗后将其置于浓度为109cfu/ml菌悬液中包衣30min；
（3）土壤预处理：对待修复的土壤翻整，浇水，施肥；
（4）栽培：待上述包衣的蓖麻种子和向日葵种子阴干后，播种在污染土壤中，实行混合种植，向日葵与蓖麻间隔分布，株距0.5~1.0m，二者种植比例1:1；
（5）管理：当苗高10cm时进行间苗，拔除生长过密的细弱幼苗，并结合中耕除草一次，在苗高17~20cm时即可定苗，并进行第二次中耕除草，在开花前可进行第三次中耕除草，当苗高30cm时，结合中耕进行培土壅蔸，固定根部；
（6）移除及后续处理：一段时间后移除所有蓖麻与向日葵，对移除的植株进行无公害处理，提取其中的cu、pb、as元素。
进一步地，所述步骤（1）中lb液体培养基的组成为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl5g/l，用naoh调整ph为7。
进一步地，所述步骤（4）中蓖麻种子和向日葵种子先在温度为25℃、相对湿度为65%的沙土中萌发，待幼苗出土长出3~4片真叶时，带泥移栽到污染土壤中，移栽后每隔3~5天浇水一次，到成活为止。
进一步地，所述步骤（2）菌悬液中添加有新高脂膜、磷酸二氢钾、尿素混合溶液。
进一步地，所述步骤（4）中蓖麻和向日葵在污染土壤中混种，同种植株间隔种植，向日葵和蓖麻间距0.5~1.0m。
进一步地，所述步骤（5）管理过程中因蓖麻的吸肥力强，前期需要氮肥多，开花后以施磷钾肥为主；更优地，多施用堆厩肥或土杂肥等混合草木灰作基肥。
进一步地，所述步骤（6）还包括在移除前两周在土壤里施加螯合剂。
进一步地，当cu、pb、as浓度超过一定阈值时，在所述修复方法前还需对污染土壤进行淋洗预处理，所述阈值依据金属类型而不同，依据下述实施例的试验结果，本发明确定了cu、pb、as的阈值范围。
其中，菌悬液浓度测定采用稀释平板计数法测定菌悬液浓度；所述步骤（2）中采用添加新高脂膜进行拌种处理，可以有效隔离病毒感染，不影响萌发吸胀功能，加强呼吸强度，提高种子发芽率，添加尿素可以为蓖麻萌发时缺氮期提供充分的氮素；所述步骤（6）无公害处理可以是灰化、焚烧、堆肥与压缩填埋等处理方式中的一种。
对所述步骤（1）~（4）设置相同条件未接菌植物种子的对照组，对比接菌植物与未接菌植物在种子萌发和幼苗成长阶段。结果发现，枯草芽孢杆菌对蓖麻和向日葵的生长发育产生了不同的影响，枯草芽孢杆菌处理的蓖麻和向日葵相比未接菌的植物，其生长发育均呈现良性增长趋势。具体来讲，枯草芽孢杆菌促进蓖麻的发芽，利于蓖麻株高的伸长和生物量的增加；枯草芽孢杆菌更益于向日葵根系的发育。
为具体分析枯草芽孢杆菌对植物生长的影响，对所述步骤（1）~（4）设置相同条件的未接菌植物种子对照组，进行了植株干重测量试验。当接种枯草芽孢杆菌的蓖麻、向日葵生长和混种蓖麻向日葵90d，取长势具有代表性的植株沿土面剪取植株地上部，同时洗出根系。收割的植物用去离子水快速洗净，样品在90℃下杀青30min，30℃烘干至恒重，烘干的样品粉碎过200目筛备用。结果显示，接菌后的植株对cu、pb、as的吸收量均有一定程度提升。其中，接菌蓖麻对cu、pb、as的吸收量分别增大12.3%、8.2%、11.2%；接菌向日葵对cu、pb、as的吸收量分别增大21.1%、17.3%、12.1%；接菌混种中，向日葵对cu、pb、as的吸收量分别增大23.4%、19.5%、12.1%，蓖麻对cu、pb、as的吸收量分别增大15.1%、8.7%、11.8%。
实施例1
实施例1采用利用向日葵、蓖麻接种枯草芽孢杆菌修复cu、pb、as污染土壤的方法来试验本发明效果，具体步骤如下：
将枯草芽孢杆菌转接到lb液体培养基中，该lb液体培养基的组成为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl5g/l，用naoh调整ph为7，在（29±1）℃下摇床培养24h后，在冷冻离心机上8000r/min离心10min，弃上清液，用灭菌的磷酸盐缓冲液冲洗菌体两次，最后将菌体溶解在无菌水中，即为备用的菌悬液；选取饱满的蓖麻和向日葵种子，先用1%的naclo浸泡20min表面消毒，再用无菌水冲洗后将其置于浓度为109cfu/ml菌悬液中包衣30min，种子包衣量的测定采用稀释平板计数法，经枯草芽孢杆菌包衣的蓖麻种子平均带菌量为0.98×105cfu/粒，经枯草芽孢杆菌包衣的向日葵种子平均带菌量为0.75×105cfu/粒；待上述包衣的蓖麻种子和向日葵种子阴干后在四种不同浓度的cu、pb、as污染土壤中播种。对待修复的土壤翻整，浇水，施肥；待上述包衣的蓖麻种子和向日葵种子阴干后，播种在污染土壤中；蓖麻前期以氮肥为主，开花后以施磷钾肥为主，当苗高10cm时进行间苗，拔除生长过密的细弱幼苗，并结合中耕除草一次，在苗高17~20cm时即可定苗，并进行第二次中耕除草，在开花前可进行第三次中耕除草，当苗高30cm时，结合中耕进行培土壅蔸，固定根部；移除前两周在土壤里施加螯合剂，移除蓖麻与向日葵。
试验通过蓖麻与向日葵对不同浓度的cu、pb和as的富集试验考察植物修复处理复合污染土壤能力。结果采用生物富集系数进行衡量，生物富集系数反映土壤-植物体系中，cu、pb、as元素迁移的难易程度以及植物对cu、pb、as元素的富集能力，其测定方法如下：
取植物地上部分样品0.5g、根部样品0.1g置于陶瓷坩锅中进行植物样品消解，同时配制空白样、标准样和平行样品进行质量控制。用火焰原子吸收分光光度法测定cu、pb和as浓度，并利用式1计算生物富集系数。
bcf=cp/cs式1
式中：cp、cs分别为植物体内该cu、pb、as含量、土壤中该cu、pb、as含量。
试验结果如表2所示，植物的种类及生理生化特性、cu、pb、as生物毒性差异以及植物对cu、pb和as响应与富集机制都影响着对cu、pb和as的吸收效率。当cu+pb+as浓度为600+800+200mg/kg时，蓖麻和向日葵对cu的富集量达到最大。当cu+pb+as浓度超过一定范围后，其生物富集系数明显变小，说明cu、pb和as等重金属毒性对植物的生长产生影响，进而影响植物根部吸收cu、pb、as离子的通道，在低浓度时植物通过酶活性的调控，依然可以保持对cu、pb、as的吸收，但当cu、pb、as浓度超过一定阈值时，可能导致植物毒害甚至死亡，直接抑制植物根部对cu、pb、as的富集。当cu、pb、as浓度过高时，我们可以采取对污染土壤进行淋洗，降低cu、pb、as浓度，然后再采用本方法来修复污染土壤。经过试验发现，当出现cu浓度超过800mg/kg，pb浓度超过1600mg/kg，as浓度超过400mg/kg情况之一时，向日葵或蓖麻对cu、pb、as的富集效率出现明显下降。综合来看，向日葵和蓖麻修复效果不错，具有修复土壤cu、pb、as污染的潜在应用价值，适合作为南方cu、pb和as复合重金属污染土壤植物修复技术的首选富集植物。
表2蓖麻和向日葵在四种不同浓度的cu、pb、as污染土壤中的表现
注：bcf生物富集系数，cu+pb+as浓度单位mg/kg。
实施例2
为了深入了解本发明中利用向日葵、蓖麻接种枯草芽孢杆菌修复cu、pb、as污染土壤的方法在处理cu、pb、as复合污染土壤情况，现采用接种枯草芽孢杆菌的蓖麻和向日葵对赣州豪丰cu、pb、as复合污染场地进行了为期一年的修复试验。
原赣州豪丰冶金化工实业有限公司是一家私营企业，由于其生产工艺及设备落后，导致主要污染物严重超标排放，既浪费资源，又严重影响区域环境质量。目前该厂已全面停产，厂区建（构）筑物已全部拆除，所有装置设备、原辅材料及可利用设备均搬迁，厂场地土地处于废弃状态。土壤采样按60m×60m网格布点，并在厂区原主要生产车间、仓库、污水处理池等重点污染区和敏感区加密布设采样点；同时，在场地边界外设置对照采样点位。土壤对照点布置于厂区主导风向上风向位置，检测指标与土壤样品检测指标一致。根据检测结果（表3）可知，豪丰污染场地污染因子主要为铜、铅、砷。
表3土壤监测结果（单位：mg/kg）
考虑到部分区域存在较高的污染负荷（cu浓度超过800mg/kg，pb浓度超过1600mg/kg，as浓度超过400mg/kg），在修复前，先对这些区域进行土壤淋洗预处理cu、pb、as污染场地。淋洗完成后采取以下步骤对cu、pb、as污染土壤进行修复：
（1）将枯草芽孢杆菌转接到lb液体培养基中，该lb液体培养基的组成为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl5g/l，用naoh调整ph为7，在（29±1）℃下摇床培养24h后，在冷冻离心机上8000r/min离心10min，弃上清液，用灭菌的磷酸盐缓冲液冲洗菌体两次，最后将菌体溶解在无菌水中，即为备用的菌悬液；
（2）选取饱满的蓖麻和向日葵种子，先用1%的naclo浸泡20min表面消毒，再用无菌水冲洗后将其置于浓度为109cfu/ml菌悬液与新高脂膜、磷酸二氢钾、尿素混合溶液中包衣30min；
（3）对待修复的土壤翻整，浇水，施肥；
（4）蓖麻种子和向日葵种子先在温度为25℃、相对湿度为65%的沙土中萌发，待幼苗出土长出3~4片真叶时，带泥移栽到污染土壤中，采用混合种植，向日葵和蓖麻间距0.9m，向日葵间株距1.8m，蓖麻间株距1.8m，移栽后每隔3~5天浇水一次，到成活为止；
（5）当苗高10cm时进行间苗，拔除生长过密的细弱幼苗，并结合中耕除草一次，在苗高17~20cm时即可定苗，并进行第二次中耕除草，在开花前可进行第三次中耕除草，当苗高30cm时，结合中耕进行培土壅蔸，固定根部；
（6）通过为期一年的修复试验后，移除所有蓖麻与向日葵，对移除的植株进行无公害处理，提取其中的cu、pb、as元素。