利用杂交水稻品种“甬优12”修复高浓度林丹污染土壤的方法与流程

本发明涉及土壤污染植物修复领域。具体地说是一种利用杂交水稻品种“甬优12”在修复高浓度林丹污染土壤的同时实现水稻安全生产、林丹污染农田安全利用的方法。

背景技术：

农药六六六(hexachlorocyclohexane,hch)是一种广谱性的有机氯杀虫剂，其有8种同分异构体，其中具有杀虫性能的是γ-hch异构体，又名林丹，曾在我国大量生产并用于防治蝗虫、稻螟虫、小麦吸浆虫和蚊、蝇、臭虫等。林丹具有化学性质稳定、半衰期长、不易分解和亲脂性的特点，在20世纪80年代初期，我国已禁止林丹等有机氯农药的使用，2010年林丹被认定符合《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》规定的筛选标准，增补进受控的持久性有机污染物名单。有研究表明，林丹对环境生物具有极高的毒性，并且具有较高的生物富集性，其在金鱼体内的生物富集系数bcf可达1000以上[文献1：刘济宁,吴冠群,石利利,等.林丹环境安全性评价研究[j].农业环境科学学报,2011,30(9):1842-1846.]。林丹也具有远距离环境迁移潜力，在各种环境介质中都具有极强的稳定性，在空气、水、土壤、沉积物、水生和陆地生物和食品中都有监测到，因此很容易在食物链中发生生物积累，并对人体内分泌系统和免疫系统造成潜在的危害，其主要症状包括恶心、烦躁、头痛、呕吐、抽搐、共济失调等[文献2：liliniu,chaoxu,yijunyao,etal.status,influencesandriskassessmentofhexachlorocyclohexanesinagriculturalsoilsacrosschina.environ.sci.technol.2013,47,12140-12147]。

林丹在自然条件下降解缓慢，其在土壤中的半衰期可达17-68天，在水中的半衰期可达30-300天，并且有报道称根据水温的变化，其在海水中的半衰期可以从1.2至19年不等[文献1：刘济宁,吴冠群,石利利,等.林丹环境安全性评价研究[j].农业环境科学学报,2011,30(9):1842-1846.]。现有针对林丹降解的研究工作十分有限，且主要在水体中展开，采用生物方法修复林丹污染的基础研究仍较为薄弱，田间修复机制和相关技术更为鲜见。

研究表明，林丹的非生物降解过程主要包括化学转化过程、水解作用、光解作用、氧化作用和还原作用等。如用灭菌的产甲烷淤泥进行试验，林丹在金属卟啉，如vb12存在时可转化为氯苯[文献3：marksts,allpressjd,maulea.dehalogenationoflindanebyavarietyofporphyrinsandcorrins.[j].applied&environmentalmicrobiology,1989,55(5):1258-61.]。朱荣淑等(2015)以稀土负载改性tio2对林丹进行光催化降解，结果表明：在紫外光下负载量为0.03％的ce/tio2为所考察的最佳催化剂，能达到91％的降解率；在可见光下负载量为1.0％的er/tio2活性最佳，可将200μg/l林丹降解22％[文献4：朱荣淑,田斐,曾胜.稀土元素负载改性tio2紫外光催化降解林丹[j].中南大学学报自然科学版,2015(3):1166-1173]。

林丹的生物降解过程则主要是微生物转化过程，指一些可以利用林丹做碳源或电子受体的微生物，在一定的环境条件下合成生物酶对林丹进行催化转化，包括好氧矿化作用、还原脱氯作用、共代谢作用等。有氧生物降解主要是一些真菌通过释放胞内酶和胞外酶来共同作用实现林丹的好氧矿化降解，且胞内酶起主要催化作用。如肖鹏飞等利用白腐菌株phlebiabrevisporatmic34596在温度为30℃,ph值为6.0的条件下，对林丹进行降解。实验发现，在白腐真菌释放的胞内酶的作用下，32.0％的林丹在30min内被降解去除，2h后降解率达57.1％。与此相比，胞外酶的降解活性较低，在相同时间内(2h)只降解了约12.2％的林丹。并且从降解曲线可以看出，在整个培养时间内，胞内酶对林丹的降解率均为胞外酶的4–5倍[文献5：肖鹏飞,秦必达,王剑桥.白腐菌phlebiabrevisporatmic34596对林丹的酶促降解特性[j].安全与环境学报,2014(6):161-164:]。而在厌氧环境中，厌氧微生物主要通过专一性的脱氯呼吸和非专一性的共代谢来实现还原脱氯转化林丹，机制与有氧条件下的好氧矿化降解完全不同。有研究表明，厌氧条件下，用淤泥混合培养物降解林丹，10天后降解率可达99％[文献6：sahusk,patnaikkk,bhuyans,etal.mineralizationofalpha,gamma-,andbeta-isomersofhexachlorocyclohexanebyasoilbacteriumunderaerobicconditions.[j].j.agric.foodchem,1995,43(3):833-837]。

目前针对林丹的植物修复研究主要在旱作条件下开展，修复机制侧重于植物生长对好氧矿化林丹的促进作用。相关研究表明，一些旱作植物品种，如芝麻、麻风树、金雀花、菠菜、玉米等都具有加速降解林丹的潜力，机制主要在于根系分泌物可向根际微生物提供其生长所需的碳源和能量，从而进一步促进了部分好氧微生物对林丹的矿化降解。然而，在以往的研究中，还未发现针对稻田淹水环境中林丹降解水稻资源的筛选和厌氧降解机制的研究，开展相关功能水稻品种筛选及原位修复应用迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种利用杂交水稻品种“甬优12”修复高浓度林丹污染土壤的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用杂交水稻品种“甬优12”修复高浓度林丹污染土壤的方法：在林丹高浓度污染土壤上种植杂交水稻“甬优12”，从而实现去除土壤中过量林丹的目的；

所述林丹高浓度污染土壤为林丹浓度≥20mgkg^-1的林丹土壤；

杂交稻“甬优12”在植株生长阶段(在培育过程中)不定期浇水，使土壤保持淹水状态。

注：水稻可以一直种到成熟期，水稻能够正常生长，植株积累林丹量较低，水稻籽粒中无林丹检出，水稻品质不受污染影响。

60天，处于水稻的分蘖期。

作为本发明的利用杂交水稻品种“甬优12”修复高浓度林丹污染土壤的方法的改进：保持淹水深度为2-3cm。

在本发明中，保持适当的淹水深度有利于营造厌氧环境，从而促进林丹的快速降解，有效减小林丹残留对土壤生态系统的影响。同时为满足水稻生长需求，应保持足够的水分条件。

水稻生长阶段应保持适当的淹水深度。幼苗移栽后，水稻处于返青阶段，需水量较大，应保持淹水深度约为3cm左右，以防发生干苗等现象，不利于幼苗成活。水稻分蘖阶段，为促进水稻根系快速生长，田间水层可保持2cm左右，有利于提高水温和土壤温度。

作为本发明的利用杂交水稻品种“甬优12”修复高浓度林丹污染土壤的方法的进一步改进：所述杂交稻“甬优12”对土壤中高浓度林丹的去除率显著高于常规粳稻“秀水519”和常规籼稻“黄华占”。

本发明所采用的水稻(oryzasatical.)品种“甬优12”属迟熟三系籼粳杂交稻，茎秆粗壮，抗倒性较强；感光性强，生育期长；分蘖力中等，穗大粒多。丰产性好。米质中等。中抗稻瘟病和条纹叶枯病，中感白叶枯病，感褐稻虱。

在本发明中，

杂交稻品种“甬优12”对林丹高浓度污染土壤(林丹浓度≥20mgkg^-1的林丹土壤)具有耐受性。即，杂交稻“甬优12”对高浓度林丹的去除率显著高于常规粳稻“秀水519”和常规籼稻“黄华占”。

在培育过程中，根系泌氧量为：所述杂交稻“甬优12”小于常规粳稻“秀水519”和常规籼稻“黄华占”，而根际可溶性有机碳含量为所述杂交稻“甬优12”高于常规粳稻“秀水519”和常规籼稻“黄华占”，因此，所述杂交稻“甬优12”种植对淹水土壤厌氧环境的破坏小，并提供更多微生物易利用碳源，进而导致其对淹水土壤中与典型土壤还原过程耦合的快速还原脱氯作用的抑制效应比常规粳稻“秀水519”和常规籼稻“黄华占”更低。

即，在林丹污染土壤中种植杂交水稻品种“甬优12”，其根系泌氧量小，而根际可溶性有机碳含量高，对淹水土壤厌氧环境的破坏小，且提供更多微生物易利用碳源，因此对淹水土壤中与典型土壤还原过程耦合的快速还原脱氯作用的抑制效应低。

在林丹污染土壤中种植杂交水稻品种“甬优12”，该品种水稻根际微生物组的装配较常规水稻品种更为稳定，即，林丹污染胁迫下，杂交稻“甬优12”的根际微生物组比常规粳稻“秀水519”和常规籼稻“黄华占”更稳定；对林丹污染的胁迫抵御性更强。

在林丹污染土壤中种植杂交水稻品种“甬优12”，水稻可利用其自身根际及其共存微生物群落体系发生还原脱氯过程，实现高效降解土壤中的林丹的作用，进而降低水稻生长受到污染胁迫的影响。

在林丹污染土壤中种植杂交水稻“甬优12”，水稻生长的培育条件、其根际微生物可促进土壤中林丹降解，当水稻生长至成熟时，水稻生长不受林丹污染影响，且根系林丹积累量很小。

林丹在好氧条件下的降解速率远远低于其在厌氧条件的降解速率，而目前针对促进土壤中林丹污染修复的研究主要集中在旱作植物品种的筛选。但尽管如此，较低的林丹的残留效应依然会对淹水厌氧条件下的地下生态系统造成巨大影响。因此，关注水稻在淹水条件下的品种筛选和种植效应，有助于进一步减小林丹的残留效应对农田地下生态系统的危害。

本发明具有如下技术优势：

本发明采用植物修复技术治理林丹污染土壤，与传统污染治理方法相比，具有技术工艺简单，成本低，不影响稻米生产和品质，不破坏农田生态环境，不造成二次污染，且可实现污染稻田“边生产边修复”的目的。通过对比三种在长江中下游广泛种植的典型常规粳稻(“秀水519”)、常规籼稻(“黄华占”)和杂交稻(“甬优12”)对低浓度(5mgkg^-1)和高浓度(20mgkg^-1)林丹污染土壤的修复效果，结果显示，杂交稻“甬优12”种植对林丹的降解具有最佳效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明所采用的杂交水稻品种“甬优12”与常规粳稻(“秀水519”)、常规籼稻(“黄华占”)在培养60天时土壤中林丹残留量对比图；

图2为本发明所采用的杂交水稻品种“甬优12”与常规粳稻(“秀水519”)、常规籼稻(“黄华占”)在修复过程中植物林丹积累量对比图；即，为不同水稻品种60天时水稻根系林丹积累量对比图；

图3为本发明所采用的杂交水稻品种“甬优12”与常规粳稻(“秀水519”)、常规籼稻(“黄华占”)根系泌氧量和土壤可溶性有机碳含量对比图；

图4为本发明所采用的杂交水稻品种“甬优12”与常规粳稻(“秀水519”)、常规籼稻(“黄华占”)根际微生物群落多样性对比图；

图5为本发明所采用的杂交水稻品种“甬优12”与常规粳稻(“秀水519”)、常规籼稻(“黄华占”)在林丹污染下的根际微生物组对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

试验地点设在浙江省杭州市浙江大学紫金港校区温室内，盆栽试验土壤采自浙江省嘉兴市无污染的水稻土(30°50’8.74″n,120°43’3.68″e)。

温室试验共设3组处理，分别为杂交稻“甬优12”处理，常规粳稻“秀水519”处理和常规籼稻“黄华占”处理。每个处理设置无污染、5mgkg^-1和20mgkg^-1的污染梯度，并各设置三个平行重复。将供试土壤风干并过2mm筛后，先用丙酮溶解所需林丹污染物(99％纯度)，加入少量供试土壤中，代丙酮完全挥发后(大于24h)，将其拌入全部供试土壤中，充分混匀后装入塑料盆(r＝10cm，h＝20cm)。每盆装土2kg，淹水平衡一星期待用。

供试水稻购自浙江省农科院，且均为长江中下游地区广泛种植的水稻品种。挑选颗粒均匀饱满的水稻种子，自来水洗净后依次用70％乙醇浸种30秒和10％naclo溶液浸种10分钟用于种子表面杀菌，再用超纯水充分清洗。将种子置于超纯水中浸泡24h后转移到湿润的纱布上，于25℃黑暗环境中培养1周。待种子萌发后依次转移幼苗至1/2强度和全强度的水稻营养液中各培养1周，然后选择生长一致的植株进行后续试验。水稻营养液配方来自国际水稻研究所《水稻生理研究实验手册》。用0.1mnaoh和0.1mhcl调节ph至5.5，以维持水稻幼苗的正常生长，每3天更换一次营养液。育苗试验在浙江大学紫金港校区农生环大楼人工气候室内(14h光照，光照强度150μmolm^-2·s^-1，昼夜温度为25℃/20℃，相对湿度70％～75％)进行。

待水稻幼苗培育两周后，筛选长势一致的幼苗将其移栽至盆中。不定期浇水，保持土壤水层深度约为2-3cm，有利于营造水稻生长的厌氧条件，维持水温和土壤温度，减少昼夜温差，为水稻根系正常生长创造良好的生长环境。在水稻生长至60天时采集植物样和土壤样品。所有样品均分为两部分，一部分用于污染浓度测定：将采集的植物样品用去离子水冲洗，沥去水分，冷冻干燥后粉碎备用。土壤样品冷冻干燥后备用。另一部分用于微生物学分析：水稻根部样品抖落松散结合土壤，而后将其浸入盛有30ml磷酸缓冲盐溶液(pbs)的离心管中，3000转涡旋15s。随后将样品转移到新的盛有30mlpbs的离心管中，超声30s，静置30s，重复3次。植物根系再次转移至新的盛有20mlpbs的离心管中，洗净，作为根内微生物提取样品。将之前含有根际土的离心管12000转离心2min，此作为根际土壤样品。随后根际微生物提取试剂盒的步骤要求进行dna样品提取并进行微生物高通量测序。

林丹测定方法：

土壤和植物的林丹提取方法采用加速溶剂萃取法。其优点在于提取时间短，提取剂用量少，提取效率高。具体方法如下：

1、仪器与试剂：气相色谱-质谱联用仪(agilent6890n)(配有ecd检测器)；色谱柱为hp-5毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)；加速溶剂萃取仪为thermoscientificase-350加速溶剂萃取仪；正己烷(hplc级)，丙酮(hplc级)，无水硫酸钠(优级纯)，高纯氮气(纯度≥99.999％)，硅藻土(农残级)

2、色谱条件：程序升温：初始温度为100℃，以10℃/min的速率升至180℃，保持1分钟，再以5℃/min的速率升至200℃，最后以20℃/min的速率升至300℃，程序升温结束。进样口温度为220℃，检测器温度为300℃，载气流速为1mlmin^-1，不分流进样。

3、前处理：准确称取土壤样品2g或植物样品0.5g，加入硅藻土混合均匀装入萃取池中(该萃取池此时刚好装满)。萃取剂为体积比1∶1的正己烷∶丙酮混合溶液。预热5min，加速溶剂萃取仪压力10.3mpa，萃取温度60℃，静态萃取5min，冲洗体积60％，循环2次，氮吹60s。合并提取液，过弗罗里硅spe柱(6ml,1g)进行净化。淋洗液为体积比7：3的正己烷∶丙酮混合溶液。净化液经氮吹，正己烷定容至1ml，供色谱分析使用。

实验结果如下：经过60天的温室培养发现，水稻生长并未受到林丹污染的影响，水稻的生长表型，如根长、株高和生物量等在采样时间点与未污染处理中的水稻没有显著差异。其中，杂交稻“甬优12”和籼稻“黄华占”的地上部分和地下部分生物量均大于粳稻“秀水519”。籼稻“黄华占”具有最大的根长和株高。

植物根系在污染处理中林丹积累量较小，在5mgkg^-1和20mgkg^-1的林丹污染处理中，常规粳稻“秀水519”的根系林丹积累量分别为0.084μg和0.205μg；常规籼稻“黄华占”的根系林丹积累量分别为0.087μg和0.184μg；而杂交稻“甬优12”的根系林丹积累量分别为0.094μg和0.181μg。低浓度下，各水稻品种植物根系积累量没有显著差异；高浓度下，杂交稻“甬优12”和常规籼稻“黄华占”的根系积累量小于常规粳稻“秀水519”(p<0.05)(如图1)。

60天采样时，在5mgkg^-1和20mgkg^-1污染处理中，杂交稻“甬优12”根际土壤林丹残留量分别为0.078和0.234mgkg^-1，常规籼稻“黄华占”根际土壤林丹残留量分别为0.091和0.300mgkg^-1；常规粳稻“秀水519”根际土壤林丹残留量分别为0.092和0.290mgkg^-1。综合对比显示，在低浓度污染条件下，尽管杂交稻“甬优12”根际土壤具有最低的林丹残留量，但结果差异并不显著；在高浓度处理中，杂交稻“甬优12”根际土壤对林丹的去除率显著高于常规籼稻“黄华占”和常规粳稻“秀水519”(如图2)。

通过原位检测水稻根系泌氧量(rol)指标发现，杂交水稻根系泌氧量最低，10h内分泌的氧气浓度平均为120μmoll^-1，而粳稻、籼稻的rol分别为129和133μmoll^-1。较高水稻的根系泌氧能力会在一定程度抑制林丹在厌氧环境中的快速降解。此外，在污染胁迫条件下，与常规水稻“黄华占”和“秀水519”相比，杂交稻“甬优12”在其根际环境中释放更多的可溶性有机碳(doc)(p<0.05)，因此可为根际微生物的生长提供更多的碳源和能量，促进相关脱氯微生物的生长(如图3)。

对比常规水稻品种(“秀水519”、“黄华占”)和杂交稻“甬优12”的微生物数据可知：林丹污染并未明显影响各水稻品种根际微生物群落的多样性，但高浓度胁迫显著抑制了常规水稻“黄华占”的根内微生物多样性(如图4)。同时，林丹污染会对根际环境中特定微生物的生长造成影响。常规水稻品种“黄华占”和“秀水519”对林丹胁迫的响应更为敏感，其在林丹污染下相对丰度显著上调和下调的微生物种类在群落中所占有的累计丰度明显高于杂交水稻。在添加林丹的处理中，与杂交稻相比，常规栽培品种相对丰度显著上调的otus有27个，而显著下降的otus有60个，说明常规水稻装配的微生物群落的丰富度小于杂交水稻。此外，常规稻和杂交稻品种间微生物组的组成具有明显差异。放线菌门、绿弯菌门和酸杆菌门等的微生物主要富集在杂交水稻的根际土壤中，而疣微菌门和拟杆菌门是常规品种中主要富集的微生物门类。在水稻根系内生菌的组成中，变形菌门、厚壁菌门和纤维杆菌门在杂交稻中富集，常规栽培品种中只包含了拟杆菌门。而已知的林丹厌氧脱氯菌，如梭菌属、芽孢杆菌属和地杆菌属等，分别属于厚壁菌门和变形菌门，因此可在杂交水稻的根际和根内环境中实现林丹的还原脱氯(如图5)。

以上微生物数据分析表明：较常规水稻品种而言，杂交水稻的根系可装配具有更为稳定的微生物群落，不仅可减小林丹污染胁迫对水稻根际环境的影响，还可快速高效的实现林丹的还原脱氯。

上述结果表明，水稻对一定程度的林丹污染具有较强的耐受能力，其生长不会受到影响。种植水稻及其淹水培育条件能够很好地去除土壤中的农药林丹残留，杂交稻“甬优12”在20mgkg^-1以上的高浓度污染处理中，林丹去除效果最佳，且具有较低的植物根系积累量。杂交水稻“甬优12”的根际微生物组更为稳定，受林丹污染胁迫的影响较小，且可通过林丹的快速降解降低其转运至水稻根内的含量。因此，杂交水稻“甬优12”可作为一种具有应用潜力和操作简便性的修复植物进行土壤中高浓度林丹的去除，并实现水稻的安全生产。

对比例1、将上述案例中的杂交水稻品种由“甬优12”改成如下表1所述的杂交水稻品种，其余等同于实施例1。

种植相同的时间(60天)后，土壤中林丹残留量、水稻根系林丹积累量与甬优12的对比如下表1所述。

表1

另，如果将土壤水层深度改为1.5cm或4cm，均会导致土壤中林丹残留量、水稻根系林丹积累量大于本发明所设定的技术方案所得结果。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。