一种利用好氧-厌氧两段式工艺处理园林废弃物的方法与流程

本发明属于可再生能源与环境保护领域，特别涉及一种利用好氧-厌氧两段式工艺处理园林废弃物的方法。

背景技术：

随着城市化进程的加快以及城市园林绿地面积的持续增加，包括枯枝落叶、园林绿化修剪物在内的园林绿化垃圾成为了城市固体废物的重要组成部分，给环境带来了巨大的压力。长期以来对园林废物的处理主要集中在填埋、焚烧等方式，处理成本较高，对大气和土壤产生极大影响，也浪费了园林废物这一宝贵的生物质资源。园林废物作为一种天然的木质纤维素原料是地球上丰富的可再生能源物质，若能够将其进行开发利用，在一定程度上替代不可再生资源，可减弱不可再生资源日益减少带来的压力，也为资源的循环利用提供较大的发展空间。如何合理、高效地处理和利用园林废物成了亟待解决的问题。

目前园林废弃物的利用方式有：造纸、制备园林有机覆盖物、制备生物燃料、混合堆肥等。但以上利用方式会存在占地面积大、周期长、二次污染、再生产品附加值低等问题。此外，两种或者多种方法联合处理，不仅能够提高处理效率，而且能够增加经济效益。如何将联合处理方法应用于园林废弃物，成为最大程度地实现园林废物中木质纤维素原料再利用的关键。

能源匮乏是人类发展过程中面临的严重问题，石油、煤等化石燃料的减少使人们不得不踏上寻找新能源的漫漫长路。从20世纪70年代石油危机后，生物燃料乙醇以其具有的可再生、环境友好、技术成熟、使用方便、易于推广等优势，成为替代汽油等石化燃料的理想产品，备受各国关注，其中以农作物秸秆、木材加工剩余物和园林废弃物等为主要原料生产燃料乙醇，成为第二代生物乙醇技术的核心。但是园林废弃物中的主要成分——木质纤维素结构复杂、难降解，使其生物转化率不高，在一定程度上制约了其资源化利用。

为了提高园林废弃物的能源利用效率，原材料通常需要被预处理，以破坏木质纤维素结构，提高后续生物转化率。但是传统的物理和化学预处理方法，成本高且容易产生二次污染。生物预处理方法条件温和、容易操作、无二次污染，但是现有的生物预处理方法在破坏木质纤维素结构时，对纤维素的降解率往往高于木质素，这对于制备生物乙醇是极其不利的，纤维素的降解将直接导致后续生物乙醇产量的降低。

随着世界经济的增长和人口的增加，能源短缺问题日益严重，开发可再生能源称为全球关注的热点。乙醇作为一种洁净和可再生的能源，已经受到各国政府和众多研究者的广泛重视。现阶段我国燃料乙醇的生产均以糖类或粮食为原料，进一步扩大产量将会受到资源的限制，因此采用价廉、易得的纤维质原料生产乙醇将是今后发展的必然趋势，而如何破除纤维质原料中的木质纤维素结构、提高生物乙醇产量将是未来的一个研究重点。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种选择性降解园林废弃物的方法，通过所述的方法可实现选择性降解木质素，保留尽可能多的纤维素。

本发明的又一目的在于提供所述的选择性降解园林废弃物的方法的应用。

本发明的再一目的在于提供一种利用好氧-厌氧两段式工艺处理园林废弃物的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种选择性降解园林废弃物的方法，包括如下步骤：

(1)栽培种的制备：将毛木耳auriculariapolytricha(mont.)sacc.au781接种于灭菌后的含有麦粒的底物中进行培养，得到栽培种；

(2)好氧培养：园林废弃物加水混合后得到培养底物，灭菌后接种所述的栽培种，进行好氧培养。

步骤(1)中所述的毛木耳优选在接种前先进行活化。

所述的活化培养基优选为pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20.0g，kh2po43.0g，mgso4·7h2o1.5g，维生素b18mg，琼脂25g，蒸馏水1000ml，ph自然。

所述的活化的具体操作优选为在28℃培养至菌丝长满培养基，将菌体转移至另一培养基中继续培养至菌丝长满培养基。

步骤(1)中所述的含有麦粒的底物优选包括麦粒、木屑和碳酸钙。

所述的麦粒、木屑和碳酸钙优选按质量比94:5:1进行配比。

所述的麦粒优选先进行如下前处理：麦粒洗净后在冷水中浸泡8～10h，于沸水中煮沸20～30min，沥干至含水率85～92％。

所述的木屑是指木头加工时留下的锯末粉料，不含刨花，含水率为40～50％。

所述的栽培种的制备的具体方法优选为：将活化好的毛木耳连同培养基制成圆形薄片，制得菌塞；将所述菌塞置于装有底物的容器中进行培养，直至菌丝长满容器。

所述的底物在所述的容器中的填充量优选为70％，物料不压实。

所述的容器优选为组培瓶。

所述的圆形薄片的直径优选为0.5cm，可通过打孔机制得。

所述的菌塞的加入量优选按每250ml底物加入5～7片菌塞。

所述的培养的条件为温度为28℃，湿度为60％；优选为每隔24h摇匀一次，使菌丝均匀生长。

步骤(2)中所述的园林废弃物优选先粉碎至3cm以下；所述的园林废弃物的含水率优选为40～50％。

步骤(2)中所述的培养底物中还可以加入碳酸钙。

步骤(2)中所述的培养底物中还可以添加废酵母作为好氧预处理阶段的氮源补充剂，可进一步提高毛木耳的活性，优化底物性质，所述的废酵母为啤酒生产过程中经主发酵和后发酵酿造工艺后产生的，含蛋白质、维生素和微量元素等营养物质，经干化处理，含水率在5～10％。

所述的园林废弃物、废酵母和碳酸钙优选按照质量比(90～95):(4～9):1进行配比。

步骤(2)中所述的加水优选按物料与水的质量比为1:1加入。

步骤(2)中所述的培养底物在灭菌前优选先静置8～10小时，使培养底物充分吸湿，物料均匀。

步骤(2)中所述的灭菌后接种的具体操作优选为：将所述的培养底物按每袋250～300g进行装袋，灭菌后晾凉，在菌袋两端接种栽培种。

所述的装袋优选用厚聚丙烯高压塑料袋进行。

步骤(2)中所述的栽培种的接种量优选按占灭菌前培养底物湿重的10％接种。

步骤(2)中所述的好氧培养的条件温度优选为28℃；湿度优选为60％；好氧培养的时间优选为20天。

步骤(1)、步骤(2)中所述的灭菌优选为121℃灭菌30min。

通过所述的选择性降解园林废弃物的方法，木质素选择性降解系数可达2～4，选择性高；所述的木质素选择性降解系数sv＝木质素降解率/纤维素降解率。

所述的选择性降解园林废弃物的方法在乙醇制备中的应用；由于所述的方法可选择性降解木质素并保留尽可能多的纤维素，通过所述的方法处理后的园林废弃物进行乙醇的制备，可有效提高乙醇产量。

一种利用好氧-厌氧两段式工艺处理园林废弃物的方法，包括以下步骤：将所述的选择性降解园林废弃物的方法处理后的园林废弃物为底物，加入纤维素酶、酿酒酵母进行厌氧发酵产乙醇(其方法流程图如图1所示)。

所述的底物优选为包括所述的园林废弃物和营养液，所述的营养液为麦芽汁液体培养基，其配方为蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母提取物3.0g，麦芽提取物3.0g，蒸馏水1000ml，ph自然。

所述的底物在发酵容器中的干物质质量分数优选为5～10％。

在加入纤维素酶、酿酒酵母前优选先对底物进行灭菌；所述的灭菌优选为121℃高压灭菌30min。

所述的纤维素酶的添加量优选为20～40u/gvs，进一步优选为25～30u/gvs；其中vs指原料混合料中所含有的挥发性物质的质量。

所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母gim2.188；所述的酿酒酵母的菌液浓度优选为10⁸～10⁹cfu/ml。

所述的酿酒酵母的菌液优选将酿酒酵母接种于麦芽汁固体培养基培养得到。

所述的麦芽汁固体培养基的配方为：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母提取物3.0g，麦芽提取物3.0g，琼脂粉25.0g，蒸馏水1000ml，ph自然。

所述的培养优选为在28±1℃，150rev/min下培养12～18h。

所述的酿酒酵母的菌液的接种量优选按底物总体积的5～10％接种。

所述的厌氧发酵的条件优选为28±1℃，150rev/min；所述的厌氧发酵的时间优选为7～10天，以发酵容器中乙醇浓度基本不变为准。

本发明利用了现有技术难以高效利用园林废弃物，通过利用木耳真菌进行好氧预处理，选择性降解木质素，破坏木质纤维素的顽固结构，并尽可能减少对纤维素的降解，在废物处理减害的同时可高产乙醇。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明利用真菌木耳在中温条件下进行好氧预处理园林废弃物，预处理过程无需在无菌条件下进行，条件温和，过程无需翻动，能耗低，工艺简单，可操作性强。

2、本发明利用木耳作为预处理菌剂，菌源可靠、易得，菌种容易保存，活化时间短，并且拓宽真菌木耳的应用领域。

3、本发明在预处理过程实现园林废弃物中木质纤维素的降解，其中木质素降解率高于纤维素，达到了选择性降解木质素、保留尽可能多的纤维素用于后续乙醇发酵、从而提高乙醇产量的目的。

4、本发明利用少量废酵母作为好氧预处理阶段的氮源补充剂，既提高了真菌木耳的活性，实现木质纤维素的高效降解，又减少了废酵母的环境污染，实现其资源化利用。

5、本发明实现了园林废弃物的“无害化、减量化和资源化”，具有潜在的环境效益、社会效益和经济效益，在可再生能源生产、废弃资源转化利用、固体废物生物处理技术方面具有巨大的市场和应用潜力。

附图说明

图1是本发明好氧-厌氧两段式工艺处理园林废弃物的流程示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)试验用园林废弃物取自华南农业大学，取回的校园内修剪的新鲜枯枝统一风干，经风干后含水率为40～50％，再用锯子破碎成30～40cm的木段，最后用锤式粉碎机破碎至0～3cm。

(2)试验用废酵母取自广州市珠江啤酒股份有限公司，所述的废酵母在啤酒生产过程中经主发酵和后发酵酿造工艺后产生的，含蛋白质、维生素和微量元素等营养物质，经干化处理，含水率在5～10％。试验用木耳选取auriculariapolytricha(mont.)sacc.毛木耳(紫木耳、黄背木耳)，其编号为au781，购买于广东省微生物菌种保藏中心，在微生物菌种库的编号为gimcc5.174。

(3)制备pda培养基(马铃薯200g，葡萄糖20.0g，kh2po43.0g，mgso4·7h2o1.5g，维生素b18mg，琼脂25g，蒸馏水1000ml，ph自然)，以平板划线法将冻存管中的木耳菌丝转接至pda培养基，将接有菌种的固体平板于28℃培养7天左右(以菌丝长满培养基为准)，重复上面步骤，将菌体再次转移至另外一个固体平板，继续培养7天，实现菌体活化。

(4)选购市售麦粒，除去瘪粒和杂质，用清水洗净，放入冷水中浸泡8h，于沸水中煮沸25min，沥干至含水率88.9％。测定木屑含水率，按照麦粒：木屑：碳酸钙＝94:5:1(以质量计)的比例混合均匀，装入250ml组培瓶(物料不压实，70％填充量)，121℃灭菌30min，灭菌结束后将麦粒打散，晾凉，制得栽培种底物。

所述的木屑是指木头加工时留下的锯末粉料，不含刨花，含水率为40～50％；碳酸钙为市售工业级。

(5)用直径为0.5cm的打孔器将活化好的木耳连同培养基截取圆形薄片，制得菌塞，在每个组培瓶中接种5片菌塞，使菌塞均匀的分布在步骤(4)得到的装有栽培种底物的组培瓶中。将接种后的组培瓶转移至人工气候箱中，28℃，60％的湿度，每隔24h，摇匀一次组培瓶中培养料，使菌丝在瓶内均匀生长，待菌丝长满组培瓶，即得栽培种。

(6)将园林废弃物、废酵母和碳酸钙按照95:4:1(以质量计)的比例混合均匀，添加水分至料水比为1:1(以质量计)，置于20l塑料桶内8小时，然后将物料按照每袋250g的用量装入厚聚丙烯高压塑料袋，压实，利用高压灭菌锅121℃灭菌30min。在超净工作台上将灭菌后的菌袋晾凉，并在菌袋两端接种栽培种，接种的栽培种量占灭菌前菌袋混合料质量的10％(以湿基计)。将接种好的菌袋整齐的摆放在人工气候箱内，28℃，湿度60％，静置培养20天。

(7)培养结束，采用美国nrel方法(sluiter,etal.2008)对处理前、后的园林废弃物中木质素和纤维素的含量进行测定。物料中木质素降解率为16.7％，纤维素降解率为7.3％，木质纤维素选择性降解系数为2.29。

(8)配制麦芽汁固体培养基，其配方为：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母提取物3.0g，麦芽提取物3.0g，琼脂粉25.0g，蒸馏水1000ml，ph自然。将冻存管中的酿酒酵母菌(购于广东省微生物菌种保藏中心，在微生物菌种库的编号为gim2.188)划线转接至麦芽汁固体培养基，经过3次转接后，再挑取酵母菌丝接种至麦芽汁液体培养基(除不含琼脂外，其他配方与麦芽汁固体培养基相同)，在28±1℃，150rev/min下培养16h，制得酿酒酵母菌液。

(9)将步骤(6)培养结束后的物料装入250ml发酵瓶内，加入麦芽汁液体培养基作为营养液，保证发酵瓶内物料的干物质质量分数计为5％，将发酵瓶于121℃高压灭菌30min；往灭菌后的发酵瓶中加入纤维素酶(绿色木酶，酶活性大于15u/mg，购于上海伯奥生物科技有限公司)，其加入量为30u/gvs，其中vs指原料混合料中所含有的挥发性物质的质量；再加入浓度为10⁸cfu/ml的酿酒酵母菌液，其接种量为发酵瓶物料总体积的10％(v/v，以体积计)。

(10)将发酵瓶置于28±1℃，150rev/min条件下，培养9d，至发酵瓶中乙醇浓度基本不变。发酵瓶内最终乙醇浓度为181.4g/l。其中，乙醇浓度采用重铬酸钾氧化分光光度法测定(可参见许黛君.纤维素发酵制备生物乙醇管式膜集成技术研究.天津工业大学硕士毕业论文，2015，“3.3.2乙醇含量的测定”)。

实施例2

(1)试验用园林废弃物取自华南农业大学，取回的校园内修剪的新鲜枯枝统一风干，再用锯子破碎成30～40cm的木段，最后用锤式粉碎机破碎至0～3cm。

(2)试验用废酵母取自广州市珠江啤酒股份有限公司，试验用木耳选取auriculariapolytricha(mont.)sacc.毛木耳(紫木耳、黄背木耳)，其编号为au781。

(3)制备pda培养基(马铃薯200g，葡萄糖20.0g，kh2po43.0g，mgso4·7h2o1.5g，维生素b18mg，琼脂25g，蒸馏水1000ml，ph自然)，以平板划线法将冻存管中的木耳菌丝转接至pda培养基，将接有菌种的固体平板于28℃培养7天左右(以菌丝长满培养基为准)，重复上面步骤，将菌体再次转移至另外一个固体平板，继续培养7天，实现菌体活化。

(4)选购市售麦粒，除去瘪粒和杂质，用清水洗净，放入冷水中浸泡8h，于沸水中煮沸30min，沥干至含水率91.7％。测定木屑含水率，按照麦粒：木屑：碳酸钙＝94:5:1(以质量计)的比例混合均匀，装入250ml组培瓶(物料不压实，70％填充量)，121℃灭菌30min，灭菌结束后将麦粒打散，晾凉，制得栽培种底物。

(5)用直径为0.5cm的打孔器将活化好的木耳连同培养基截取圆形薄片，制得菌塞，在每个组培瓶中接种7片菌塞，使菌塞均匀的分布在步骤(4)得到的装有栽培种底物的组培瓶中。将接种后的组培瓶转移至人工气候箱中，28℃，60％的湿度，每隔24h，摇匀一次组培瓶中培养料，使菌丝在瓶内均匀生长，待菌丝长满组培瓶，即得栽培种。

(6)将园林废弃物、废酵母和碳酸钙按照90:9:1(以质量计)的比例混合均匀，添加水分至料水比为1:1(以质量计)，置于20l塑料桶内8～10个小时，然后将物料按照每袋250g的用量装入厚聚丙烯高压塑料袋，压实，利用高压灭菌锅121℃灭菌30min。在超净工作台上将灭菌后的菌袋晾凉，并在菌袋两端接种栽培种，接种的栽培种量占灭菌前菌袋混合料质量的10％(以湿基计)。将接种好的菌袋整齐的摆放在人工气候箱内，28℃，湿度60％，静置培养20天。

(7)培养结束，物料中木质素降解率为22.3％，纤维素降解率为7.1％，木质纤维素选择性降解系数为3.14。

(8)配制麦芽汁固体培养基，其配方为：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母提取物3.0g，麦芽提取物3.0g，琼脂粉25.0g，蒸馏水1000ml，ph自然。将冻存管中的酿酒酵母菌gim2.188划线转接至麦芽汁固体培养基，经过3次转接后，再挑取酵母菌丝接种至麦芽汁液体培养基，在28±1℃，150rev/min下培养16h，制得酿酒酵母菌液。

(9)将步骤(6)培养结束后的物料装入250ml发酵瓶内，加入麦芽汁液体培养基作为营养液，保证发酵瓶内物料的干物质质量分数计为8％，将发酵瓶于121℃高压灭菌30min；往灭菌后的发酵瓶中加入纤维素酶(同实施例1)，其加入量为25u/gvs，其中vs指原料混合料中所含有的挥发性物质的质量；再加入浓度为10⁸cfu/ml的酿酒酵母菌液，其接种量为发酵瓶物料总体积的10％(v/v，以体积计)。

(10)将发酵瓶置于28±1℃，150rev/min条件下，培养10d，发酵瓶内最终乙醇浓度为207.5g/l。

实施例3

(1)试验用园林废弃物取自华南农业大学，取回的校园内修剪的新鲜枯枝统一风干，再用锯子破碎成30～40cm的木段，最后用锤式粉碎机破碎至0～3cm。

(2)试验用废酵母取自广州市珠江啤酒股份有限公司，试验用平菇选取pleurotusostreatus，其编号为p40，购买于广东省微生物菌种保藏中心，在微生物菌种库的编号为gdmcc5.539。

(3)制备pda培养基(马铃薯200g，葡萄糖20.0g，kh2po43.0g，mgso4·7h2o1.5g，维生素b18mg，琼脂25g，蒸馏水1000ml，ph自然)，以平板划线法将冻存管中的平菇菌丝转接至pda培养基，将接有菌种的固体平板于28℃培养7天左右(以菌丝长满培养基为准)，重复上面步骤，将菌体再次转移至另外一个固体平板，继续培养7天，实现菌体活化。

(4)选购市售麦粒，除去瘪粒和杂质，用清水洗净，放入冷水中浸泡8h，于沸水中煮沸30min，沥干至含水率91.7％。测定木屑含水率，按照麦粒：木屑：碳酸钙＝94:5:1(以质量计)的比例混合均匀，装入250ml组培瓶(物料不压实，70％填充量)，121℃灭菌30min，灭菌结束后将麦粒打散，晾凉，制得栽培种底物。所述的木屑含水率为40～50％。

(5)用直径为0.5cm的打孔器将活化好的平菇连同培养基截取圆形薄片，制得菌塞，在每个组培瓶中接种5片菌塞，使菌塞均匀的分布在步骤(4)得到的装有栽培种底物的组培瓶中。将接种后的组培瓶转移至人工气候箱中，28℃，60％的湿度，每隔24h，摇匀一次组培瓶中培养料，使菌丝在瓶内均匀生长，待菌丝长满组培瓶，即得栽培种。

(6)将园林废弃物、废酵母和碳酸钙按照95:4:1(以质量计)的比例混合均匀，添加水分至料水比为1:1(以质量计)，置于20l塑料桶内8～10个小时，然后将物料按照每袋250g的用量装入厚聚丙烯高压塑料袋，压实，利用高压灭菌锅121℃灭菌30min。在超净工作台上将灭菌后的菌袋晾凉，并在菌袋两端接种栽培种，接种的栽培种量占灭菌前菌袋混合料质量的10％(以湿基计)。将接种好的菌袋整齐的摆放在人工气候箱内，28℃，湿度60％，静置培养20天。

(7)培养结束，物料中木质素降解率为15.2％，纤维素降解率为32.4％，木质纤维素选择性降解系数为0.47。

(8)配制麦芽汁固体培养基，其配方为：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母提取物3.0g，麦芽提取物3.0g，琼脂粉25.0g，蒸馏水1000ml，ph自然。将冻存管中的酿酒酵母菌gim2.188划线转接至麦芽汁固体培养基，经过3次转接后，再挑取酵母菌丝接种至麦芽汁液体培养基，在28±1℃，150rev/min下培养16h，制得酿酒酵母菌液。

(9)将步骤(6)培养结束后的物料装入250ml发酵瓶内，加入麦芽汁液体培养基作为营养液，保证发酵瓶内物料的干物质质量分数计为5％，将发酵瓶于121℃高压灭菌30min；往灭菌后的发酵瓶中加入纤维素酶(同实施例1)，其加入量为25u/gvs，其中vs指原料混合料中所含有的挥发性物质的质量；再加入浓度为10⁸cfu/ml的酿酒酵母菌液，其接种量为发酵瓶物料总体积的10％(v/v，以体积计)。

(10)将发酵瓶置于28±1℃，150rev/min条件下，培养8d至发酵瓶中乙醇浓度基本不变，发酵瓶内最终乙醇浓度为128.3g/l。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。