一种碳酸盐矿化菌矿化结晶固化重金属的方法与流程

本发明涉及土壤修复领域，特别是涉及一种碳酸盐矿化菌矿化结晶固化重金属的方法。

背景技术：

在人们的生产生活中，最重要的一项生产资源就是土地资源。一切生产建设的根本都依赖于土地资源，尤其是对农业生产来说。随着社会的飞速发展，社会工业化进程的不断加快，许多工业生产环节对所在区域及周边地区的环境产生了负面甚至不可逆转的影响，废水、废气、不可降解原料在土地中沉积等，对土地资源造成了严重的污染。土地污染影响农作物的正常生长或使农作物本身含有有害物质，使农业生产受到严重影响。我国是一个农业大国，农业生产影响着国民经济的方方面面，如果不能保证农业生产的正常运转，就会造成严重的后果。面对着工业生产的污染源与保障农业生产的要求，我国急需解决的问题就是如何对土壤污染进行全面治理。

固化土壤重金属的方法通常包括：化学法、微生物法(micp)。与传统化学修复方法相比，微生物修复技术具有成本低、操作简便、无二次污染且不改变土壤原有的结构等优势。然而，现有的碳酸盐矿化菌矿化结晶效率低下，其用于微生物修复土壤时周期较长。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，针对被重金属离子所污染的土壤，本发明提供一种碳酸盐矿化菌矿化结晶固化重金属的方法。并利用此方法提高碳酸盐矿化菌矿化结晶效率，进一步缩短微生物修复土壤的周期。

为实现上述目的，本发明拟采用以下技术方案：

一种碳酸盐矿化菌矿化结晶固化重金属的方法，包括以下步骤：

(1)样品采集：从金尾矿区采集土样，将所述土样在4℃条件下备用；

(2)配制培养基：富集培养基，并筛选培养基；

(3)矿化菌的培养：在所述土样中筛选出一株碳酸盐矿化菌，接种到unb培养基中，置于30-40℃、150-180r/min下培养20-30h，所得菌液在4℃条件下备用；

(4)矿化能力鉴定：将步骤(3)所述微生物接种到含尿素、钙离子的液体培养基中，将其置于30-40℃、150-180r/min恒温振荡器中培养20-30h，观察是否有沉淀产生，若有，则进行步骤(5)；若没有沉淀产生，则重新选择另一株碳酸盐矿化菌，重复步骤(3)-(4)；

(5)添加成核剂加速固化：将在unb培养基中培养的矿化菌按0.1％的比例接种至含cacl2和pb的unb培养基中，并在其中加入1％-10％的成核剂，将其置于30-40℃、150-180r/min恒温振荡器中培养4-8d；所述成核剂为钠盐。

作为进一步优选的技术方案，还包括步骤(6)验证固话效果：在步骤(5)中的培养期间，在不同时间下通过偏光显微镜对添加不同成核剂的培养基进行测定，确定结晶情况；培养结束后，进行过滤操作，其沉淀置于40-60℃烘箱烘至恒重，称量其沉淀质量。

作为进一步优选的技术方案，所述富集培养基为液体培养基包括：蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l，ph值为7.4。

作为进一步优选的技术方案，所述的培养基在接种之前进行灭菌，灭菌条件为121℃，时间为20min。

作为进一步优选的技术方案，所述成核剂对caco3的形成有促进作用。

作为进一步优选的技术方案，所述成核剂会能够改善微生物的活力，加快酶反应的能力。

作为进一步优选的技术方案，所述步骤(1)中的土样获取后保存在无菌封闭袋中。

作为进一步优选的技术方案，所述步骤(3)中所得菌液在冰箱中保存，保存温度为4℃。

作为进一步优选的技术方案，cacl2浓度为20％-30％，优选27％。

作为进一步优选的技术方案，步骤(2)和(3)中所述的各类培养基在接种前均已灭菌，灭菌条件为121℃，时间为20min；所述培养环境均为30℃、180r/min培养24h。

作为进一步优选的技术方案，所述步骤(2)中，富集培养基的步骤具体为：使用液体培养基，包括：蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l，ph值为7.4；所述筛选培养基的步骤具体为：使用固体培养基，包括琼脂15g/l、葡萄糖1g/l、尿素20g/l、氯化钠5g/l、磷酸二氢钾2g/l、蛋白胨1g/l、1g蛋白胨、酚红0.012g/l，ph值为7.2。

作为进一步优选的技术方案，步骤(3)中所述微生物具有良好的矿化能力；所述16srdna序列的测定是由上海美吉生物医药科技有限公司完成；所述发育树的绘制是由mega-x软件构建。

作为进一步优选的技术方案，步骤(5)中所添加的成核剂中效果最好的为钠盐。

作为进一步优选的技术方案，步骤(3)中所筛选出的碳酸盐矿化菌选自于巴氏芽孢杆菌、科氏葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、解硫胺素芽孢杆菌、纺锤体赖氨酸芽孢杆菌中的一种。

本发明一种碳酸盐矿化菌矿化结晶固化重金属的方法，利用了微生物对环境适应性强、酶催化反应高效、无二次污染、成本低等优势，克服了传统化学修复法降解氰化物及固化尾矿成本高、污染环境的缺点，并在通过添加成核剂的基础上，使得整个的修复时间明显缩短，加快了微生物的修复效率。

本发明的有益效果是：

(1)采用钠盐作为成核剂，极大提高了该微生物的活力、酶催化反应能力；(2)同传统化学修复方法相比，本发明具有以下优势:无二次污染、成本低廉、反应高效的优点；(3)对于受到大量的重金属元素污染的土壤，本发明利用一种绿色的修复方法，防止重金属的迁移，钠盐具有水溶性好、对ca²⁺、mg²⁺等金属离子具有优良的螯合能力、能发生生物降解、分散能力及抗再沉积能力强等特点真正做到了零污染、零排放。

附图说明

图1为本发明的方法与对照组分别在0小时、6小时、10小时时间点的成核效果显微图；

图2为本发明的方法与对照组分别在22小时、28小时、57小时时间点的成核效果显微图；

图3为本发明的方法与对照组的碳酸钙沉淀量对比图。

具体实施方式

为了更加明确地阐述本发明的技术方案，以下结合附图进行进一步说明。

本实施例的利用新型成核剂加速碳酸盐矿化菌矿化结晶从而达到固化重金属的方法，首先进行碳酸盐矿化菌菌株的筛选和培养，制备得到高浓缩菌液，将菌株进行活化，然后将碳酸盐矿化菌接种在含不同成核剂的培养基中培养，观察在规定时间段内添加不同成核剂的培养基中结晶效果，从而得到最佳成核剂。

在实验室条件下，实施本发明的一种碳酸盐矿化菌矿化结晶固化重金属的方法，并且将本申请采用的成核剂钠盐，与成核剂为碱性氧化物、氯化物、多糖聚合物、酸性氧化物、醇类，以及无成核剂，进行以下对照试验，步骤如下：

第一步：将菌株接种到unb培养基里，于30-40℃、150-180r/min下培养20-30h，所得菌液于4℃冰箱保存备用。

第二步：矿化能力鉴定：将微生物接种到含尿素的液体培养基中，置于30-40℃、150-180r/min恒温振荡器中培养20-30h,观察是否有沉淀产生，若有，则进行后续加速结晶实验。

第三步：取50ml锥形瓶21个，加入unb培养基30ml尿素浓度为10％-20％，cacl2浓度为20％-30％，成核剂的添加量均为1％-10％，每种成核剂，平行做3份。将在unb培养基中过夜培养的矿化菌按0.1％的比例接种至含cacl2和pb的unb培养基中，并在其中分别加入1％-10％的钠盐、碱性氧化物、氯化物、多糖聚合物、酸性氧化物、以及醇类，无成核剂的培养基作为对照组，将其置于30-40℃、150-180r/min恒温振荡器中培养4-8d，培养期间，在不同时间下通过偏光显微镜对添加不同成核剂的培养基进行测定，确定结晶情况。将其进行过滤，其沉淀置于40-60℃烘箱烘至恒重，称量其沉淀质量。

对照实验结果如下：

如图1所述，在6h时添加钠盐和碱性氧化物的成核剂开始出现了结晶体，其余均未出现结晶体；而在10h这两种成核剂中的结晶效果更加明显，说明对于矿化过程具有极大的促进作用；结晶体位置如图中圆圈所示。

如图2所示，在22h时添加氯化物、多糖聚合物以及醇类成核剂的培养基中也开始呈现出结晶效果；而在28h时添加酸性氧化物的实验组和空白组也初步有了结晶的效果，而在57h时培养基中结晶效果均明显增多；结晶体位置如图中圆圈所示。

如图3所示，在矿化实验结束后，测定沉淀量，以钠盐作为成核剂的实验组沉淀量最多，优势明显。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。