一种真菌生物修复重金属镉污染水稻的有效方法与流程

[0001]
本发明属于农业微生物技术领域，涉及水稻生长环境中的重金属镉生物修复技术，具体涉及一种真菌生物修复重金属镉污染水稻的有效方法。


背景技术：

[0002]
随着人类科技和工业的迅猛发展所带来的环境的日益恶化，世界各国都注重生态的可持续发展。在全球性环境污染中，农田生态环境污染是人类最为关心的核心问题之一。在我国，农田生态环境污染虽然得到一定的遏制，但仍有日益加重的趋势。造成环境污染的重金属主要包括镉(cd)、铬(cr)、铜(cu)、铅(pb)、汞(hg)、砷(as)、镍(ni)及锌(zn)。其中有些重金属是生命活动所必需的，在微量浓度下参与生命代谢活动，如铬、铅、锌，但是它们在人体内的残留量超过一定浓度时就会对人体产生危害。重金属造成的污染具有隐蔽性、不可逆性和长期性等特点，采用物理的、工程的和化学的方法很难消除，它们一旦进入土壤、水体等生活环境中，不仅影响作物的产量和品质，并且直接或间接地通过食物链危害人类健康，而且常常对人体造成一些不可逆的损伤。如何控制和减轻重金属对植物的毒害，已引起人们的广泛关注。
[0003]
农田生态环境中的污染物主要来源于：(1)工业和交通运输业排出的大量废气沉降物；(2)工业和生活污水的灌溉以及工业废渣和生活垃圾的不当处理；(3)化肥和农药的不合理施用。另外，由于水资源的缺乏导致水资源的重复利用以及对土壤淋洗作用的减弱，也会加剧污染物在土壤中的积累。治理重金属元素对农业环境的污染倍受人们的重视。
[0004]
镉是地球化学分散元素，是在人类活动影响下在地表环境的释放和在土壤-植物系统中迁移较为活跃的元素，对动植物和人类具有较大的毒性。土壤镉的自然背景值在0.2-0.3mg/kg以下，随着现代工农业生产的飞速发展，工业“三废”、农药化肥用量、固体废弃物不断增加，镉的环境释放十分严重。据估计，每年世界范围进入土壤的镉量为2.2万吨。镉的污染为不可逆的累积过程，因其不能被土壤微生物分解且半衰期长达20年左右，另一方面，镉又是生物迁移性很强的元素，极易被植物吸收并积累，超过一定限度不仅严重影响作物的产量和品质，且通过食物链富集危害人体健康。人类对重金属的吸收途径主要以土壤-作物-食品-人体迁移为主，由于镉毒害的机制是渐进性的干扰体内肾代谢功能和骨骼形成，即使是低剂量的水平下，长期的暴露对人类健康有严重的威胁。因而生长于土壤中的农产品中的镉水平直接影响到人类的健康。
[0005]
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是全球50％以上人口的主要食物来源，是我国第一大的粮食作物，我国大约有60％以上的人口以稻米为主食，在南方农村人群的人均消费稻米达到近200kg/年。因此，稻米品质的优劣直接关系到人们的健康水平。而水稻恰被认为是吸收镉最强的大宗谷类作物。


技术实现要素：

[0006]
针对目前土壤镉污染面积广，由此种植生产的稻米镉污染比较严重，严重影响稻
米产量和质量的安全问题，本发明旨在提供一种真菌生物修复重金属镉污染水稻的有效方法，通过真菌与水稻共培养去除水稻对镉的积累，降低水稻中的镉含量。
[0007]
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008]
一种真菌生物修复重金属镉污染水稻的有效方法，包括：将白腐真菌与被重金属镉污染的水稻幼苗共培养。
[0009]
优选地，所述白腐真菌为trametespubescensmb 89，cbs 696.94。
[0010]
优选地，所述白腐真菌固定于载体上再与被重金属镉污染的水稻幼苗共培养。
[0011]
更优选地，所述载体为下沉式陶粒，所述白腐真菌与陶粒载体采用半固体培养方式培养7-14天后，将真菌固定于载体上。
[0012]
更优选地，所述陶粒载体的粒径为0.5
±
0.1cm。
[0013]
优选地，所述水稻幼苗为三叶期水稻幼苗。
[0014]
更优选地，所述水稻幼苗通过以下方法培育：将种子经过消毒清洗后转移到含有湿双层滤纸的培养皿内并保存在培养皿中在25℃下将室内放置在黑暗中3-4天，以便发芽，发芽种子转移到水稻生长基础培养液中种植在16小时光照/8小时黑暗的光周期下80％相对湿度，长到三叶期。
[0015]
优选地，水稻生长基础培养液的配方为：0.37mm(nh4)2so4，0.18mm kno3，0.37mm ca(no3)2，0.05mm fe(ii)-edta，0.001mm cuso4，0.01mm h3bo4，0.1mm nacl，0.55mm mgso4，0.18mm kh2po4，0.09mm k2so4，0.001mm znso4，0.005mm mnso4，0.0005mm na
2 moo4，0.0002mm coso4。
[0016]
本发明的有益效果如下：
[0017]
本发明使用的真菌，具有吸附并富集培养液中镉离子的能力，当与水稻共培养时，能吸附水稻培养液中镉，减轻镉对水稻的胁迫作用，减少镉在水稻根和茎中的积累，同时还能促进水稻生长，对水稻镉污染的修复有一定的积极意义。
附图说明
[0018]
图1.培养皿中trametes pubescence在不同浓度的重金属镉离子胁迫下的生长情况。
[0019]
图2.trametes pubescence在不同浓度的重金属镉离子胁迫下的生长情况统计。
[0020]
图3.trametes pubescence在不同浓度的镉离子条件下的生物吸附能力和对镉的去除情况。
[0021]
图4.trametes pubescence对高低浓度的重金属镉离子吸附情况的扫描电镜图，a：cont；b：高浓度镉(100mg/l)处理；c，d：低浓度镉(10mg/l)处理。
[0022]
图5.trametes pubescence对不同浓度的镉离子吸附的红外图谱。
[0023]
图6.真菌生物修复去除镉对水稻的毒害效应实验室模型的建立。
[0024]
图7.真菌生物修复镉污染后水稻的生长情况。
[0025]
图8.真菌生物修复重金属镉污染对水稻地上部和地下部生长的影响；a：水稻幼苗在不同处理条件下生长15天后地上部株高；b：水稻幼苗在不同处理条件下生长15天后地上部叶片数；c：水稻幼苗在在不同处理条件下生长15天后地下部根长；d：水稻幼苗在不同处理条件下生长15天后地下部根的直径。
[0026]
图9.真菌生物修复前后水稻地上部和地下部镉积累量对比。
[0027]
图10.真菌生物修复前后水稻根部横截面石蜡切片。
[0028]
图11.真菌生物修复前后水稻根尖纵截面石蜡切片。
具体实施方式
[0029]
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[0030]
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0031]
实施例
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一、真菌吸附重金属镉的机制研究
[0033]
1.1真菌trametes pubescence对镉的耐受实验
[0034]
申请人通过国际交流合作项目，得到一株在含有重金属污染废水中分离纯化的真菌。于是我们进行了真菌耐受重金属镉的实验。通过实验证明，真菌trametes pubescence可以耐受一定浓度的重金属镉离子胁迫，最大耐受浓度为100mg/l，在200mg/l的pda固体平板上不生长，如图1和图2所示。正常的自来水标准是0.005mg/l，该真菌的最大耐受浓度为正常水中镉离子浓度的20000倍，表现出很强的镉耐受性，为进一步研究微生物对重金属的生物去除以及微生物和重金属镉相互作用的研究奠定了一定的基础。
[0035]
1.2真菌trametes pubescence暴露在不同浓度的镉离子溶液中的吸附率
[0036]
通过摇瓶实验，使用不同浓度梯度的镉离子对纯培养的真菌trametes pubescence进行镉胁迫实验，以探究真菌对不同浓度的镉溶液的吸附能力。实验表明，当镉离子浓度为100mg/l时，真菌trametes pubescence的最大吸附量可以达到6.565mg/g(如图3a所示)，去除率在镉离子浓度为10mg/l的条件下最高为53.13％(如图3b所示)。
[0037]
1.3扫描电镜观察真菌暴露在镉溶液中细胞形态的变化
[0038]
通过摇瓶实验，使用不同浓度梯度的镉离子对纯培养的真菌trametes pubescence进行镉吸附实验，在扫描电子显微镜下，与对照组(图4a)相比，观察到低浓度镉对真菌菌丝有一定的破坏作用(如图4c所示)，同时可以观察到真菌菌丝对镉有一定的吸附作用(如图4d所示)，可能是发生了螯合作用。高浓度镉将菌丝碎片化(如图4b所示)，从摇瓶中也可以明显看出有碎片化的菌丝产生。1.4红外光谱表征真菌在镉胁迫下细胞表面官能团应答机制
[0039]
通过对吸附镉离子前后菌丝红外图谱的对比发现，吸附前后真菌红外图谱发生了一些变化，主要变化见图5、表1所示。
[0040]
其中，氨基和羟基的伸缩振动峰从3487.32(对照组)偏移至3419.93(5mg/l)、3405.40(10mg/l)、3390.31(50mg/l)、3402.99(100mg/l)，说明这些来自多糖、脂肪酸和蛋白质组分的羟基和氨基参与了吸附过程。2928附近为c-h伸缩振动峰，在吸附后图谱发生轻微移动表明c-h键参与了镉的吸附过程。1651处为n-h氨基官能团的伸缩振动。图谱显示的1077cm-1
波段低强度的振动偏移，c-o键的振动。对吸附前后红外光谱分析可得，官能团n-h、c＝o、-oh、c-h、c-o等可能参与了镉离子的吸附过程。
[0041]
表1.trametes pubescence对不同浓度的镉离子吸附的红外光谱吸收峰波段偏移
情况
[0042][0043]
二、真菌生物修复去除镉对水稻的毒害效应实验室模型的建立
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2.1实验材料
[0045]
包括：水培缸、白腐真菌及载体、水稻生长基础培养液、漂浮板、定植杯及定植棉、发育一周水稻秧苗。
[0046]
其中：
[0047]
白腐真菌为trametespubescensmb 89(cbs 696.94；centraalbureauvoorschimmelcultures,utrecht,the netherlands)。
[0048]
载体为下沉式陶粒，粒径为0.5cm。
[0049]
水稻生长基础培养液的配方为：0.37mm(nh4)2so4，0.18mm kno3，0.37mm ca(no3)2，0.05mm fe(ii)-edta，0.001mm cuso4，0.01mm h3bo4，0.1mm nacl，0.55mm mgso4，0.18mm kh2po4，0.09mm k2so4，0.001mm znso4，0.005mm mnso4，0.0005mmna
2 moo4，0.0002mm coso4。
[0050]
其他材料如未特殊说明，均为市购常规材料。
[0051]
2.2实验设计如下：
[0052]
实验设置三组：a真菌去除镉污染实验组，b镉污染未修复实验组(不加任何修复措施)，c无镉正常生长对照组。每组设置三个平行水培缸，每个水培缸中放置3个定植杯，每个定植杯中栽培9颗水稻。
[0053]
a组和b组的水培缸中分别加入镉离子浓度为10mg/l的氯化镉溶液，c组不加为对照组。
[0054]
2.3实验方法
[0055]
2.3.1白腐真菌与陶粒载体采用半固体培养方式培养7天后，将真菌固定于载体上，使用时将真菌与载体一同投放至水稻水培缸中。
[0056]
该步骤中，白腐真菌与陶粒载体的半固体培养可采用现有技术手段实现，本申请中，参考“simultaneous production of laccase and decolouration of the diazo dye reactive black 5in a fixed-bedbioreactor”(journal of hazardous materials 164(2009)296-300)中公开的真菌的培养方法进行。
[0057]
2.3.2水稻秧苗培育方法：将种子经过消毒清洗后转移到含有湿双层滤纸的培养皿内并保存在培养皿中在25℃下将室内放置在黑暗中3-4天，以便发芽。发芽种子转移到培养液中种植在16小时光照/8小时黑暗的光周期下80％相对湿度待长到三叶期，选取均匀长
度的幼苗，移栽入营养液培育装置，每组3株。
[0058]
2.3.3培养
[0059]
a)置于室温为25℃相对湿度为80％的组培架上培养15天，光照与黑暗每12小时交替一次。
[0060]
b)经过15天的培养，观察水稻生长发育情况，测量地上部分和地下部分表观参数，分别收获水稻苗的地上部分茎叶和地下部分根，干燥后，浓硝酸消解后原子吸收光谱测定法测定茎叶和根中的cd含量。
[0061]
经过两周的培养，真菌与水稻根部共培养体系建立，如图6所示。从而，一方面真菌保护了水稻的根部，另一方面真菌吸收了环境中的大部分镉，减轻了镉对水稻的毒害作用。
[0062]
需要说明的是，培养时间不限于15天，通常，只要给水稻补充足够的营养液，可以持续共培养；15天后如果不给水稻补充培养液，水稻会因为缺乏营养而枯萎。
[0063]
三、真菌生物修复水稻镉污染的修复效果
[0064]
3.1不同处理条件下的水稻形态学特征
[0065]
镉对植物的毒害，在形态上主要表现为根、茎生长迟缓和叶片失绿、卷曲生理生化方面，多表现为光合作用和蒸腾作用受到抑制，引起氧化胁迫和膜的损伤。图7可以看出，与未被镉污染的正常对照组(cont)相比，镉首先引起水稻根的损伤，根部生长受到了明显的抑制，地上部分也表现出茎叶短小，生长迟缓的现象，即图中cont(cd)所示。可能的原因是镉胁迫会降低水稻叶绿素含量，损伤光合系统i和ii，降低叶片中的电导率，减少二氧化碳的吸收，干扰气孔的开放，从而造成水稻生长迟缓。而经过真菌修复的水稻根茎叶，即图中tp(cd)所示，较对照组都生长良好。
[0066]
同时，真菌生物修复重金属镉污染对水稻地上部和地下部生长的影响如图8所示，由图中可见，经过真菌修复的重金属镉污染水稻幼苗tp(cd)组生长15天后地上部株高(图8a)、叶片数(图8b)以及地下部根长(图8c)均优于未被污染的正常对照组cont，而地下部根的直径虽小于未被污染的正常对照组，便与被镉污染的对照组cont(cd)相比，也有明显增加(图8d)。
[0067]
3.2真菌生物修复对镉在水稻根茎中积累量的影响
[0068]
镉被水稻吸收后，大部分富集在根部，迁移至地上部的较少。通过原子吸收检测镉在水稻地上部分和地下部分的积累量，表明水稻根部富集镉的量是茎叶部的10倍，这是由于，水稻对进入体内的重金属离子进行区域化，即将其累积在不同细胞中或细胞间的液泡中。这些植物通过排斥或在局部使重金属富集，使重金属在植株根部细胞壁沉淀而“束缚”其跨膜吸收，从而提高对重金属的忍耐度。所以根部镉的积累量远远大于地上部分茎叶中镉的积累量。
[0069]
通过真菌与水稻共培养，真菌吸附一部分镉，使得水稻根中吸收的镉的量减少53.5％，同时，经过真菌的生物修复后的水稻地上部分镉的积累量明显减少，降低了86.38％，结果如图9所示。根据镉在水稻不同组织中的分布，以新陈代谢旺盛的器官蓄积量大，而营养储存器官中蓄积量少，通常在水稻体内的分布顺序是根大于茎大于叶大于子实，可以推测生物修复后水稻子实及稻米中的镉含量相应的会显著降低。
[0070]
3.3镉毒害及真菌修复对水稻根部细胞形态的影响
[0071]
重金属镉离子干扰根系对矿质养分的吸收和运输，造成植物的营养缺乏。镉离子
胁迫可使植物根尖细胞退化，水分吸收和运输机制受到破坏，水势降低，气孔关闭，从而干扰养分的吸收。
[0072]
从水稻根部的横截面切片结果(图10)来看，镉对水稻根部的细胞形态造成了严重的损害，细胞发生变形老化，而与真菌共培养的体系中根部细胞得到了一定的保护，且由于真菌对镉的吸附作用，降低了培养液中镉的浓度，减轻了镉对水稻根部细胞的毒害作用。从水稻根的纵截面切片结果(图11)来看，镉可胁迫水稻根尖细胞退化，根部变细，受伤。而与真菌共培养的水稻根尖与正常组相似，并无明显变化，故证明真菌与水稻共培养可以显著改善镉对水稻根部的伤害，保护水稻根尖细胞，从而保证根对营养物质的正常吸收运输。
[0073]
重金属镉离子胁迫对水稻的损伤是一个非常复杂的过程。重金属胁迫通过对蛋白质、膜系统及dna的损伤，进而使水稻的生长发育、物质与能量的代谢造成影响。水稻在遭受重金属胁迫时，会产生相应的防御措施，保护酶系统(sod、pod)被激活，两者相互协调，清除膜脂过氧化造成的大量活性氧自由基，维护细胞膜系统的稳定性。由于酶的活性有一定限度，随着镉胁迫的加深，重金属对酶系统造成不可逆的损伤，最终导致植物受到毒害，甚至死亡。
[0074]
本发明构建了真菌与水稻共培养的体系，通过真菌对重金属镉的吸附及富集，减轻镉对水稻的胁迫作用，减少镉在水稻根和茎中的积累。同时，真菌与水稻共培养保护了水稻根部细胞，使得水稻根部可以正常的吸收培养液中的营养，得以正常生长。而且，真菌还可以合成多种对水稻生长有利的化学物质，对水稻的生长起到促进作用，帮助水稻对营养物质的吸收，缓解重金属镉对水稻的胁迫作用。
[0075]
可以理解的是，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。