一种快速鉴定植物净化富营养化水体能力的方法与流程

本发明涉及水体净化技术领域，具体涉及植物净化富营养化水体能力的鉴定。

背景技术：

随着社会的高速发展，工业和农业带来的水污染形势格外严峻。富营养化水体严重破坏水生生态系统，并对当地气候和野生动物产生负面影响。水体中存在的污染物通常可分为物理性污染物、化学性污染物和生物性污染物，目前，国内外用于净化富营养化水体的方法主要有物理净化法、化学净化法、生物学净化法、自然净化法四大类，自然净化法是提高水体自净功能以去除污染物质的一种净化方法，该类方法十分环保，是当前国内外水体生态修复研究开发的重点。植物净化是自然净化法的重要方面，

不同植物对富营养化水体的净化效果大不相同，已有的对植物净化富营养化水体效果的检测指标集中在水质中的总氮、总磷、化学需氧量的检测上。但不同植物在富营养化水体中的生理生态响应机制及抗逆机制也有很大不同。已有的鉴定水生植物净化富营养水体能力的方法，主要通过检测水体指标来反应的，耗时较长，在野外试验过程中，水体是不断变化的，仅对水体指标进行检测的方法，易受外界因素影响，不够准确。没有考虑处于逆境(富营养化水体)中的植物自身的抗逆机制对其净化能力的影响。

技术实现要素：

为解决现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供能够准确评价植物对富营养化水体净化能力的方法。

本发明的第一方面提供一种评估水生植物抗逆性水平的方法。包括，计算逆境中水生植物的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性及相对电子传递速率的隶属函数值，将各个隶属函数值累加得到抗逆性综合值。

逆境可以是富营养化水体，具体地，富营养化水体可以是总氮、总磷及化学需氧量为《地表水环境质量标准》ⅴ类水或总氮、总磷及化学需氧量为《地表水环境质量标准》中ⅴ类水的1-12倍。

本发明的第二方面，提供一种快速鉴定植物净化富营养化水体能力的方法，包括计算处于富营养化水体中植物的可溶性糖、可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性及相对电子传递速率的隶属函数值，累加得到抗逆性综合值。其中，述抗逆性综合值越高，植物净化富营养化水体的能力越强。

在得到快速鉴定植物净化富营养化水体能力的方法的过程中，发明人进行了以下探究。探究的技术路线图如图1。发明人选择9种植物，设置三种不同浓度(低浓度、中浓度、高浓度)的富营养化水体，将9中植物培养在三种不同浓度的富营养化水体中。

(1)检测植物净化过程中富营养化水质指标，包括总氮、总磷、总化学需氧量、水体透明度、ph及温度；

(2)检测植物净化富营养化水体过程中植物生长情况，包括株高、鲜重、根长；

(3)植物净化富营养化水体过程中荧光参数测定，包括，光化学淬灭系数、光合量子产额、最大光化学量子产量、相对电子传递速率；

(4)植物净化富营养化水体过程中生理指标测定，包括可溶性糖、过氧化物酶、可溶性蛋白含量。

发明人进一步探究上述检测指标与植物净化富营养化水体的能力是否存在相关性，选取最具相关性的指标进进行隶属函数值的累加。具体地，一种快速鉴定植物净化富营养化水体能力的方法，包括以下步骤：

(1)测定种植于富营养化水体2-4天时，植物的可溶性糖、可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性及相对电子传递速率；

(2)测定种植于富营养化水体n天时，植物的可溶性糖、可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性及相对电子传递速率，其中n＞4；

(3)当步骤(2)与步骤(1)中的植物的可溶性糖、可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性及相对电子传递速率存在显著性差异时，计算步骤(2)中植物的可溶性糖、可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性及相对电子传递速率的隶属函数值，累加得到抗逆性综合值。

(4)通过抗逆性综合值，判断植物净化富营养化水体的能力，判断标准为：

0＜抗逆性综合值≤1，植物净化富营养化水体能力弱；

1＜抗逆性综合值≤2，植物净化富营养化水体能力较弱；

2＜抗逆性综合值≤3，植物净化富营养化水体能力较强；

3＜抗逆性综合值，植物净化富营养化水体能力强。

本发明提供所述方法在判断高磷和/或高氮环境下的植物抗逆性水平中的应用；或该方法在挑选适合的植物种植于富营养化水体中的应用；或该方法在水体净化中的应用，所述的水体为生活污水或工业废水。

本发明提供风还车草、花叶芦苇和/或狐尾藻在净化富营养化水体中的应用。

本发明的有益效果：

(1)步骤简易、操作简单，采用本发明所述方法，在只测定四个生理指标后，即可鉴定出植物对富营养化水体的净化能力。

(2)适用场景广泛、受水体变化的影响小，本发明所述方法可用于实验室及野外环境中处于富营养化水体的水生植物。

(3)耗时短，采用本发明所述方法，在植物开始响应富营养化水体时，即可鉴定出植物净化富营养化水体的能力。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

图2为本发明实施例2中植株增重与中浓度富营养化水体中tn去除率的关系。

图3为本发明实施例2中植株增重与中浓度富营养化水体中tp去除率的关系。

图4为本发明实施例2中植株增重与高浓度富营养化水体中tn去除率的关系。

图5为本发明实施例2中植株增重与高浓度富营养化水体中tp去除率的关系。

图6为本发明实施例3中植物在三种不同浓度富营养化水体中的fv/fm值。

图7为本发明实施例3中植物在三种不同浓度富营养化水体中的yield值。

图8为本发明实施例3中物在三种不同浓度富营养化水体中的qp值。

图9为本发明实施例3植物在三种不同浓度富营养化水体中的retr值。

图10为本发明实施例5中tn、tp综合去除率与抗逆性综合值的回归分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若无特殊说明，本发明实施例中所用试剂耗材均为市售，且实施例中所有实验至少独立重复3次，表中同列不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

实施例1

挑选风车草(cyperusinvolucratus)、花菖蒲(irisensata)、黑三棱(sparganiumstoloniferum)、花叶香蒲(typhalatifoliavariegata)、泽泻(alismaplantago-aquatica)、花叶芦苇(phragmitesaustralisvar.variegata)、狐尾藻(myriophyllumverticillatum)、萍蓬草(nupharpumila)、睡莲(nymphaeatetragona)等9种植物作为试验材料。

试验场地避雨且有自然光照。采用塑料桶进行静态水培试验，周期为29d。浓度的确定参照《地表水环境质量标准》(gb3838-2002)。试验采用葡萄糖，氯化铵，硝酸钾，磷酸二氢钾模拟富营养化水体水质，并设置3个不同浓度梯度。低浓度相当于其中的ⅴ类水，中、高浓度的设定在参考相关文献的基础上，以低浓度为基础，增加一定倍数。初始水质指标见表1。

表1试验初始水质指标

选取生长健壮、长势一致的植物苗，在清水中预培养15-20d，待其长出新根。用蒸馏水冲干净洗后，将植物表面水渍擦拭干净，并移至硬质泡沫塑料浮床(20cm*20cm*2cm)上。固定好植物后，将其置于盛有11l水的塑料水桶(13l)中。植物种植密度为2株/桶。每个处理设3次重复，另外设无植物的空白对照。试验期间定期用蒸馏水补充蒸发水分，以保持桶内水体积不变。塑料桶随机摆放于北京林业大学苗圃园中。

实施例2植物在富营养化水体中生长指标的变化及影响

检测水体富营养化指标，包括总氮(tn)、总磷(tp)、化学需氧量(codcr)。水样指标依据中国环境监测标准，并参考国家环保局最新监测方法进行检测，tn采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(gb11894-89)测定，tp采用钼酸铵分光光度法(gb11893-89)测定，codcr采用连华公司5b-3(b)型cod多元速测仪进行测定。

各富营养化水体指标的去除率参考吴卿(吴卿,王美,许吟波,等.不同植物生物栅系统对富营养化景观水净化试验[j].水土保持学报,2013,27(4):171-175.)按下列公式计算：去除率(％)＝[(co-ci)/co]×100％，其中，co为试验开始时水体中污染物的质量浓度；ci为第i天时水体中污染物的质量浓度。

植株单位去除量参考汪小将(汪小将,陈晓汉,何安尤,等.邕江南宁段水域营养盐变动趋势及相关性分析[j].广西水产科技,2008(4):10-13.)，按下列公式计算：单位去除量(mg/g)＝(co-ce)×v/δw，其中，co为试验开始时水体中污染物的质量浓度；ce为试验结束时水体中污染物的质量浓度；v为水体体积；δw为试验期间植株鲜重增加量。

水质每7d检测一次。取样时间为9:00-10:00am，取样前先用玻璃棒在水桶内搅拌数下，然后抽取水面下10cm处水样。水样取后立即酸化并存于4℃冰箱，并在24h之内分析完毕。测定结果见表2、表3、表4。

试验结束时植株株高、鲜重、根长的量减去其初始值，即为株高、鲜重、根长的增量。计算时，各桶中水质指标与桶中植物的生长指标一一对应。

表2植物对tn的单位去除量

表3植物对tp的单位去除量

表4植物codcr的单位去除量

由上述表2、表3、表4可知，不同植物对同种富营养化水体中tn、tp、codcr的单位去除量不同，同种植物对不同富营养化水体中tn、tp、codcr的单位去除量存在显著差异(p<0.05)。供试的9种植物中，花叶芦苇、花菖蒲对tn的单位去除量较高，花叶芦苇、泽泻对tp的单位去除量较高，花叶芦苇对codcr的单位去除量较高。

计算植物增重与各营养指标去除效果之间的相关性。因codcr浓度的变化受到水体ph、微生物等影响较大，故对tn、tp去除率与植物增重做回归分析。中浓度条件下，tn与tp的去除率拟合接近直线，数据的离散性较大，见图2、图3。高浓度条件下，tn与tp的去除率拟合曲线近似对数函数，且数据较为集中，见图4、图5。植株增重与tp去除率的相关性要强于其与tn去除率的相关性

实施例3检测植物叶绿素荧光参数的变化

试验第三天上午10:00-11:00期间，用便携式调制叶绿素荧光仪pam-2500测定par(光合有效辐射)，以及叶片在光适应下的最大荧光f’和fm’，并在当夜晚无光照条件下，测定暗适应后植株叶片的最小荧光fo和最大荧光fm。测量时保持仪器角度一致，并使叶片平展。每个处理10个重复。

计算得出fv/fm(psii原初光能转化效率)、yield(光合量子产额)、qp(光化学猝灭系数)、retr值(表观电子传递速率)。公式参照文献(gentyetal.，1989；kooten&snel，1990)。在10个重复中，分别去掉两个最高和最低值，将剩余的6个值进行结果分析。

(1)fv/fm

fv/fm能够反映植物的最大光合能力，供试植物fv/fm值如图6所示。不同富营养化处理后，各植物fv/fm值均在0.740-0.810之间，不同植物之间fv/fm值差异显著(p<0.05)。采用onewayanova单因素分析后发现，风车草、花叶香蒲、萍蓬草在三种不同处理下的fv/fm值存在显著性差异(p<0.05)。其中，风车草fv/fm值呈“中浓度>高浓度>低浓度”的变化规律；花叶香蒲fv/fm值呈“高浓度>中浓度>低浓度”的变化规律；萍蓬草fv/fm值呈“中浓度≈高浓度>低浓度”的变化规律。其余植物在三种不同处理下的fv/fm值不存在显著性差异。fv/fm值较稳定，表明在三种浓度富营养化水体下，植物的最大光合能力并未受到太大影响。

(2)yield

yield能够反映植物的实际光合效率。供试植物yield值如图7所示。供试的9种植物之间yield值差异显著(p<0.05)。从低浓度到中浓度条件，yield值普遍呈上升趋势，其中花叶香蒲、狐尾藻yield值较低浓度时分别上升了0.121、0.119，表明中浓度富营养化水体对其光合作用具有较好的改善作用；萍蓬草和睡莲yield值略有升高，而花菖蒲和花叶芦苇的yield值则较为稳定，表明其光合作用对富营养化程度升高反应不大；从中浓度到高浓度条件，yield值普遍呈下降趋势，大部分植物的yield值符合“中浓度>高浓度>低浓度”这一规律，可见富营养化程度低时，植株因缺乏营养光合效率低，随着富营养化程度升高，植物的光合作用加强，但是富营养化程度超过一定范围后，又将抑制植物的光合作用。

(3)qp

qp值为光化学淬灭系数，反映了psⅱ反应中心的开放程度。供试植物qp值如图8所示。供试的9种植物之间qp值差异显著(p<0.05)。各植物qp值的变化与yield值的变化趋势相似。从低浓度到中浓度条件，qp值普遍呈上升趋势，其中风车草、黑三棱增量最大，分别为0.253、0.170、0.159；花菖蒲、花叶芦苇、睡莲的qp值较为稳定。从中浓度到高浓度条件，qp值普遍呈下降趋势。

(4)retr

各植物retr值的变化如图9所示，9种供试植物的retr值差异显著(p<0.05)。从低浓度到中浓度条件，retr值普遍呈上升趋势，其中狐尾藻、睡莲增量最大，分别为53.081、42.261，表明中浓度富营养化水体加速了其电子传递速率；花菖蒲和花叶芦苇的retr值较为稳定，表明富营养化程度升高对其电子传递速率影响不大。从中浓度到高浓度条件，retr值普遍呈下降趋势，而风车草、花叶芦苇、狐尾藻retr值仍然呈现上升趋势。

实施例4检测植物生理生化指标的变化

分别于试验第3天和第25天获取植物叶片，并将其置于-80℃的超低温冰箱中，用于测定植物的生理指标。各生理指标测定方法如下：

1、可溶性糖含量测定

可溶性糖含量的测定采用蒽酮法，结果见表5。

表5植物可溶性糖含量的变化

注：1、2分别代表试验第3天和第25天时的可溶性糖含量平均值。

2、可溶性蛋白含量测定

可溶性蛋白测定参考马斯亮蓝g-250染色法，稍作调整，每个处理三次重复。取0.1g植物材料，放入预冷的研钵中，加入2.5ml预冷的0.05mol·l^-1，ph7.8磷酸缓冲液，加入少量石英砂，冰浴研磨成匀浆，用2.5ml缓冲液冲洗研钵，倒入50ml离心管中，于4℃、10000r·min^-1下离心15min，所得上清液置于4℃冰箱中待用。

取酶上清液1ml，加入5ml考马斯亮蓝试剂，在振荡器上充分混匀，放置2min后在595nm波长条件下测吸光度值。结果见表6。

表6植物可溶性蛋白含量的变化

注：1、2分别代表试验第3天和第25天时的可溶性蛋白含量平均值。

3、pod活性测定

过氧化物酶(pod)活性测定采用愈创木酚法(李忠光,龚明.愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的改进[j].植物生理学通讯,2008(02):323-324.)，稍作调整，每个处理三次重复。取0.1g植物材料，放入预冷的研钵中，加入2.5ml预冷的0.05mol·l^-1，ph7.8磷酸缓冲液，加入少量石英砂，冰浴研磨成匀浆，用2.5ml缓冲液冲洗研钵，倒入50ml离心管中，于4℃、10000r·min^-1下离心15min，所得上清液即为pod酶液，置于4℃冰箱中待用。

在5ml离心管中加入3ml反应混合液(每28微升愈创木酚溶解于50ml0.1mol·l^-1，ph＝6.0磷酸缓冲液后，再加入19微升l30％h2o2混合均匀)，再加入0.1ml-0.2ml酶液，对照为等量的磷酸缓冲液，在470nm下测定2min内吸光度值的变化，重复3次，计算每分钟内pod的活性变化。结果见表7。

表7植物过氧化物酶活性的变化

注：1、2分别代表试验第3天和第25天时的过氧化物酶量平均值。

实施例5植物抗逆性综合值

采用模糊数学中隶属函数法对植物抗逆性进行综合评价，用microsoftexcel2017对数据进行处理并绘图，microsoftexcel2017及spss22.0进行数据分析。采用duncan法进行多重比较，pearson法进行相关性分析。

根据实施例3与实施例4的结果分析，选择ss(可溶性糖含量)、sp(可溶性蛋白含量)、pod(过氧化物酶活性)、retr(相对电子传递速率)四个生理指标，以中浓度条件下的生理指标值为对照，将高浓度条件下的生理指标分别计算出隶属函数值，最后将隶属值进行累加得到不同植物在高浓度富营养化水体中的抗逆性综合值，结果见表8。

表8植物在高浓度富营养化水体中生理指标的综合分析

由表8可知，在高浓度富营养化条件下，风车草、花叶芦苇、狐尾藻的抗性较强，综合值分别达到了3.742、2.732、2.396。而萍蓬草的抗性较弱。将9种植物在高浓度条件下对tn、tp的综合去除率与对应的抗逆性综合值做相关性分析，发现它们呈极显著正相关，r＝0.675(n＝9)。对其进行回归分析，如图10所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。