一种微生物菌剂载体材料制备方法及在高密度水产养殖中的应用与流程

1.本发明涉及微生物技术及应用领域，尤其涉及一种微生物菌剂载体材料制备方法及在高密度水产养殖中的应用。


背景技术：

2.随着水产养殖产业的迅猛发展和集约化经营的不断提高，现在还存在不少问题：
3.(1)目前市场上常规的水产养殖，氨氮和亚硝酸盐含量过高、ph值不适、化学需氧量(cod)过高、溶解氧含量过低，高密度养殖系统中，残饵、粪便及动植物尸体等有机污染物沉积量较大，外加药物残留和外源污染物过多等，这些有机物在厌氧微生物的分解作用下产生大量有害物质，如氨态氮、亚硝酸盐、硫化氢等，直接危害水产养殖动物；
4.(2)针对这种异常，常规处理方式手段则是不断添加药物、抗生素、化学试剂等，这些试剂药物的添加虽然能短暂的解决问题，但是不能从根本上解决氨氮和亚硝酸盐含量过高、ph值不适、化学需氧量(cod)过高、溶解氧含量过低等问题。而且还引入了大量有毒有害物质，严重危害了食品的安全健康；
5.(3)特别对于高密度养殖的水体，由于养殖密度大，养殖面积有限，所以水体的自净能力非常有限，到了养殖的中后期，常常会因为水质的变坏导致疾病的发生；
6.(4)水质稳定性差，水产品质量和安全性差；养殖密度和单位效益难以提高；水产养殖业的污染问题的日益突出；
7.(5)菌株的负载低和释放快不持久，普通菌液或粉剂需要频繁投放；现有微生物制剂难以用于流动及开放水体环境的难题。


技术实现要素：

8.有鉴于所述，本发明的目的在于提供一种微生物菌剂载体材料制备方法及在高密度水产养殖中的应用，通过利用微生物在人为促进工程化条件下，分解水体中污染物，降低养殖池塘水体中氨氮、亚硝酸盐的浓度，修复受污染的环境。
9.本发明为实现上述目的所采取的的技术方案为：
10.一种微生物菌剂载体材料制备方法，包括：竹炭前处理、培养基配制、菌液制备、菌泥制备、微生物固定以及海藻酸钠包裹；
11.s1，竹炭前处理的步骤：a1、取竹炭将其放入105℃烘箱内烘干4h；a2、取烘干后的竹炭分装于1l三角瓶中，每瓶装竹炭150g；a3、往每瓶a2三角瓶中注入250ml蒸馏水，盖上塑料隔膜；a4、将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅中121摄氏度灭菌20min；a5、取出三角瓶a4，等三角瓶冷却至室温后将三角瓶中水倒出备用；
12.s2，培养基配制的步骤：b1、配置lb肉汤培养基，将配置后的lb培养基依次分装入500ml三角瓶和250ml三角瓶中，盖上塑料薄膜，于瓶身制标记“lb”；
13.b2、将分装于三角瓶后的lb肉汤培养基放入高压蒸汽灭菌锅中121摄氏度灭菌
20min；
14.s3，菌液制备的步骤：c1、从冰箱中取出菌种，用10μl的接种环接种1环至s2中已灭菌的250ml三角瓶培养基中。将接种后的培养基放置于32摄氏度、200r/min摇床培养24h；c2、将摇床培养后培养基从摇床取出，按10％接种量接种至s2中已灭菌的500ml三角瓶培养基中；c3、将c2接种后的培养基放置于32摄氏度、200r/min摇床培养24h，观察菌生长情况，是否污染；
15.s4，菌泥制备及微生物固定的步骤：d1、将已灭菌的离心管取出，将s3中放大培养的菌液依次倒入对应的离心管中5000r/min离心5min，去上清液后即可得到菌泥；d2、取已干热灭菌的三角瓶，用已灭菌的蒸馏水将菌泥重悬，并将重悬菌泥调节od600至1.2
±
0.1，取调节od600后菌液倒入装有s1中灭菌后的竹炭的三角瓶中，每瓶倒入250ml，盖上塑料薄膜，放入摇床32摄氏度，200r/min培养24h；
16.s5，海藻酸钠包裹的步骤：e1、配置4％海藻酸钠溶液，将溶液放入80摄氏度水浴锅中溶解，溶解后取出放凉待用；e2、配置1.38％氯化钙水溶液；e3、将固定培养后的s4中的三角瓶从摇床取出，倒去上清；e4、将放凉后的4％海藻酸钠溶液倒入s4中装有竹炭的三角瓶中混匀包裹，再用镊子将包裹海藻酸钠后的竹炭一粒粒取出放入1.38％氯化钙溶液中，静止包裹固化4h；e5、倒去氯化钙溶液，将e4中包裹后的竹炭取出放于自封袋中保存，即可得到微生物菌剂载体材料。
17.优选地，s1中，所述竹炭为多孔材料载体，为微米级三维蜂巢结构生物碳材料，密度1.05g/cm3的固体材料，所述竹炭内微生物负载量》10亿cfu/g。
18.优选地，s2中，所述菌液为复合微生物菌液，菌液中菌种的型号包括qb-1、qx-1、psb、乳酸菌，具体微生物菌种包括光合细菌、假单胞菌、硝化细菌、反硝化细菌、乳酸菌。
19.优选地，s5中，4％的海藻酸钠溶液和1.38％氯化钙水溶液体积比为1:10。
20.本发明还公开了上述微生物菌剂载体材料在高密度水产养殖中的应用。
21.本发明的另一个目的在于提供一种为高密度水产养殖环境提供稳定可持续的水质净化和生态保持解决方案，解决了现有微生物制剂难以用于流动及开放水体环境的难题。
22.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
23.上述方法制备得到的微生物菌剂载体材料。配合缓释增氧材料投放至高密度水产养殖场中，刚好沉到水底浮泥层发挥作用，不会流失漂走，实现泥水同治，将微生物菌种固化到蜂巢样微米多孔竹炭材料载体上，沉降到水底稳定附着，为有益微生物菌群提供独特的人工微环境，达到一次投放，长久有效的效果；通过利用微生物在人为促进工程化条件下，分解高密度水产养殖场水体中污染物，降低养殖池塘水体中氨氮、亚硝酸盐的浓度，修复受污染的环境，且还能协助提高微生物的生物活性的微生物菌剂载体。
24.优选地，所述缓释增氧材料包括释氧剂、凹凸棒土、硬脂酸和pvp。
25.优选地，所述微生物菌剂载体材料和缓释增氧材料均为密度1.05g/cm3的固体材料。
26.优选地，所述微生物菌剂载体材料和缓释增氧材料的质量比为2:1。
27.优选地，微生物菌剂载体材料在高密度水产养殖中改良水体环境的应用。
28.优选地，微生物菌剂载体材料在高密度水产养殖中提高养殖户养殖密度及降低鱼
体病害发生的应用。
29.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
30.(1)本发明一种微生物菌剂载体材料制备方法及在高密度水产养殖中的应用利用微生物菌剂产品(qb-1、qx-1、psb、乳酸菌)为主；固态为辅(微生物沉底缓释材料、缓释增氧材料)，为高密度水产养殖环境提供稳定可持续的水质净化产品和生态保持解决方案，大幅减低农药、抗生素的使用，重点解决水质稳定性差、水产品质量和安全性差、养殖密度和单位效益难以提高的难题，加快转变水产养殖业发展模式，创建绿色低碳、持续发展的新的发展模式；
31.(2)微生物菌剂载体材料密度1.05g/cm3，刚好沉到水底浮泥层发挥作用，不会流失漂走，实现泥水同治；同时配合缓释增氧材料应用，达到氧气持久缓慢释放，使水体持续增氧；
32.(3)乳酸菌是一类能产生乳酸的革兰氏阳性细菌，乳酸菌菌剂可作为鱼饵料拌料，可有效调节鱼类肠道微生物群落结构稳定，同时抑制杂菌，而产生的代谢产物也可提升饵料的利用率，同时，在水体中加入乳酸菌制剂，还可有效改善水质，降低鱼体病害发生。微生物菌剂载体材料能够有效调节鱼类肠道微生物群落结构稳定，同时抑制杂菌生长、提高饵料利用率、降低亚硝酸盐等功效；
33.(4)微生物菌剂载体材料具有改良水体环境，抑制病原菌生长、恢复清洁水环境、降解有毒有害物质，同时增加含氧量，有效规避氨含量过高而阻碍水体动物的健康生长，有益微生物在水体中达到一定的数量，就会形成特定的种群，这样在生存竞争中，有益微生物就会抑制有害微生物的生长，这样就会在很大程度上提高水体的质量，使水体保持一个很好的稳定状态，从源头解决传统养殖的农药、抗生素、废水排放问题；
34.(5)本发明以固体微生物沉底材料为载体，液态微生物菌剂为水剂，从源头解决传统水产养殖农药、抗生素、废水排放、环境污染破化等问题，实现水产养殖生态化，自然化，真正恢复了水体自净能力，达到长治久清、生态优良的根本目标；
35.(6)本发明将微生物菌种固化到蜂巢样微米多孔竹炭材料载体上，材料沉降到水底稳定附着，解决了现有微生物制剂难以用于流动及开放水体环境的难题，为有益微生物菌群提供独特的人工微环境，达到一次投放，长久有效的效果；
36.(7)本发明利用无害生物菌剂抑制水产养殖中的弧菌等病原菌，实现工厂规模养殖，实现增产、降低饵料系数；利用自然环境中的微生物或使用特定的微生物在人为促进工程化条件下，分解污染物，降低养殖池塘水体中氨氮、亚硝酸盐的浓度，修复受污染的环境。
附图说明
37.图1为湖北宜都鲟鱼谷养殖水体水质净化案例中第一次实验氨氮检测结果。
38.图2为湖北宜都鲟鱼谷养殖水体水质净化案例中第一次实验亚硝酸盐检测结果。
39.图3为湖北宜都鲟鱼谷养殖水体水质净化案例中第二次实验氨氮检测结果。
40.图4为湖北宜都鲟鱼谷养殖水体水质净化案例中第二次实验亚硝酸盐检测结果。
41.图5为鱼缸实验氨氮检测结果。
具体实施方式
42.下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步说明。给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
43.实施例1：
44.一种微生物菌剂载体材料制备方法，包括：竹炭前处理、培养基配制、菌液制备、菌泥制备、微生物固定以及海藻酸钠包裹；
45.s1，竹炭前处理的步骤：a1、使用天平称取竹炭750g，将其放入105℃烘箱内烘干4h；a2、取烘干后的竹炭分装于1l三角瓶中，每瓶150g，共分装4瓶；a3、往每瓶三角瓶中注入250ml蒸馏水，盖上塑料隔膜；a4、将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅中121摄氏度灭菌20min；a5、取出三角瓶，等三角瓶冷却至室温后将三角瓶中水倒出备用；
46.s2，培养基配制的步骤：b1、配置lb肉汤培养基1.1l，将1.1l lb培养基依次分装入4个500ml三角瓶中，每瓶装入200ml；2个500ml三角瓶中，每瓶装入100ml；2个250ml三角瓶，每瓶装入50ml，盖上塑料薄膜，于瓶身制标记“lb”；b2、将lb肉汤培养基放入高压蒸汽灭菌锅中121摄氏度灭菌20min；
47.s3，菌液制备的步骤：c1、从冰箱中取出菌种，用10μl的接种环接种1环至已灭菌的培养基(50ml)中。将接种后的培养基放置于32摄氏度、200r/min摇床培养24h；c2、将摇床培养后培养基从摇床取出，按10％接种量接种至100ml与200ml已灭菌的三角瓶中，记上对应标签；c3、将接种后的培养基放置于32摄氏度、200r/min摇床培养24h，观察菌生长情况，是否污染；
48.s4，菌泥制备及微生物固定的步骤：d1、将已灭菌的离心管取出，将s3中放大培养的菌液依次倒入对应的离心管中5000r/min离心5min去上清，去上清液后即可得到菌泥，并依次记录每个菌体体积；d2、取已干热灭菌的三角瓶，用已灭菌的蒸馏水将菌泥重悬，并将重悬菌泥的调节od600至1.2
±
0.1，取调节od600后菌液倒入装有s1中灭菌后的竹炭的三角瓶中，一瓶倒入250ml，盖上塑料薄膜，放入摇床32摄氏度，200r/min培养24h；
49.s5，海藻酸钠包裹的步骤：e1、往8g海藻酸钠中加入200ml水，配置4％海藻酸钠200ml，将溶液放入80摄氏度水浴锅中溶解，溶解后取出放凉待用；e2、配置1.38％氯化钙水溶液2l；e3、将固定培养后的三角瓶从摇床取出，倒去上清；e4、将放凉后的海藻酸钠倒入装有竹炭的三角瓶中混匀，用镊子将竹炭一粒粒放入氯化钙溶液中，静止包裹4h；e5、倒去氯化钙溶液，将包裹后的竹炭取出放在自封袋中保存，即可得到微生物菌剂载体材料。
50.实施例2：
51.湖北宜都鲟鱼谷养殖水体水质净化案例，取实施例1中制备得到的微生物菌剂载体材料，配合缓释增氧材料应用于中国清江(宜都)鲟鱼谷养殖项目、清水湾(深圳)大鹏对虾养殖项目，如图1-4所示：应用效果非常理想，固定化微生物产品投入后，水中的氨氮、亚硝酸盐等下降非常明显，水体中氧含量明显增加。
52.水产养殖业的集约化生产方式的发展，经历了池塘、开放式流水池和网箱方式等阶段，现在进入工厂化的循环水养殖发展阶段。相比较前三种方式，工厂化养殖具有降低了对环境和资源的依赖程度；降低了对环境的影响程度的优势，工厂化养殖是水产养殖业的发展方向。但是，国内的循环水养殖企业缺乏相关的经验，没有专业的循环水养殖技术人
员，没有可参考的工厂化循环水养殖技术数据，养殖密度不容易控制，无法对水质做到有效的调控。利用公司研发菌种及制剂，能够很好的控制水中氨氮、亚硝酸盐等对鱼有毒性的浓度，提高养殖户养殖密度，增进经济效益。
53.在该实施例中，在养殖池中按根据0.1千克/立方水的用量添加qb-1微生物沉底缓释材料，定期检测水中水温、ph、溶解氧、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐指标，监测水质。在此实施例中一共开展两次监测。
54.两次实验检测结果表明，与空白组相比，添加微生物沉底材料的实验组氨氮、亚硝酸盐明显较低。且两次实验组的亚硝酸盐组间差距明显小于空白组。说明本发明在水产养殖运用中具有比较明显的效果，能够降低养殖水体污染，提高养殖密度。
55.实施例3：
56.鱼缸实验氨氮检测，如图5所示，实验选取3个50l鱼缸，随机分为50g qb-1组、100gqb-1组、空白组，50g qb-1组添加50g微生物沉底缓释材料qb-1，100gqb-1组微生物沉底缓释材料qb-1，空白组添加50g普通生物炭设为空白对照。实验结果表明，与空白相比，添加了微生物沉底缓释材料qb-1的鱼缸，水中氨氮能够维持较低水平，保证鱼缸水质，降低养殖技术门槛。因为能够将氨氮控制在较低水平，因此可以降低鱼缸换水频率，减轻养殖工作量。
57.本发明微生物菌剂目前在多个水产养殖项目上应用，例如：中国清江鲟鱼谷、大鹏临海海洋生物产业创新示范基地、江苏南美白对虾养殖场、桂花鱼、鲈鱼养殖项目、高密度养殖项目、水族箱净化项目，应用效果非常理想，微生物菌剂产品投入后，水中的氨氮、磷、亚硝酸盐等下降非常明显，水体中氧含量明显增加。
58.通过长期合理地应用微生态制剂必定会使养殖水域形成有益微生物菌群的生态优势，起到促进养殖活动健康发展的良性循环作用。中生息的微生物或使用特定的微生物在人为促进工程化条件下，分解污染物，降低养殖池塘水体中氨氮、亚硝酸盐的浓度，修复受污染的环境。
59.应用生物修复技术就是保证水产养殖资源的可持续利用和产业可持续发展，是目前生物技术研究发展的一个重要领域，其中环境生物修复技术的开发与应用是环境生态技术研究发展的重点。生物修复技术作为一项高效、节能的环保技术，己被国外广泛用于治理水域环境。而随着水产养殖业的污染问题的日益突出，人们极力探索改善养殖环境，净化养殖水质的方法与途径。
60.本发明的工作原理为：利用微生物菌剂产品(qb-1、qx-1、psb、乳酸菌)为主；固态为辅(微生物沉底缓释材料、缓释增氧材料)，为高密度水产养殖环境提供稳定可持续的水质净化产品和生态保持解决方案，大幅减低农药、抗生素的使用，重点解决水质稳定性差、水产品质量和安全性差、养殖密度和单位效益难以提高的难题，加快转变水产养殖业发展模式，创建绿色低碳、持续发展的新的发展模式；由于微生物菌剂载体材料密度1.05g/cm3，刚好沉到水底浮泥层发挥作用，不会流失漂走，实现泥水同治；同时配合缓释增氧材料应用，达到氧气持久缓慢释放，使水体持续增氧；微生物菌剂载体材料能够有效调节鱼类肠道微生物群落结构稳定，同时抑制杂菌生长、提高饵料利用率、降低亚硝酸盐等功效；微生物菌剂载体材料具有改良水体环境，抑制病原菌生长、恢复清洁水环境、降解有毒有害物质，同时增加含氧量，有效规避氨含量过高而阻碍水体动物的健康生长，有益微生物在水体中
达到一定的数量，就会形成特定的种群，这样在生存竞争中，有益微生物就会抑制有害微生物的生长，这样就会在很大程度上提高水体的质量，使水体保持一个很好的稳定状态，从源头解决传统养殖的农药、抗生素、废水排放问题；利用固体微生物沉底材料为载体，液态微生物菌剂为水剂，从源头解决传统水产养殖农药、抗生素、废水排放、环境污染破化等问题，实现水产养殖生态化，自然化，真正恢复了水体自净能力，达到长治久清、生态优良的根本目标；通过固化到蜂巢样微米多孔竹炭材料载体上，材料沉降到水底稳定附着，解决了现有微生物制剂难以用于流动及开放水体环境的难题，为有益微生物菌群提供独特的人工微环境，达到一次投放，长久有效的效果；利用无害生物菌剂抑制水产养殖中的弧菌等病原菌，实现工厂规模养殖，实现增产、降低饵料系数；利用自然环境中的微生物或使用特定的微生物在人为促进工程化条件下，分解污染物，降低养殖池塘水体中氨氮、亚硝酸盐的浓度，修复受污染的环境。
61.上述的实施例仅为本发明的优选实施例，不能以所述来限定本发明的权利范围，因所述，依本发明申请专利范围所作的修改、等同变化、改进等，仍属本发明所涵盖的范围。