解淀粉芽孢杆菌在制备用于降解诺氟沙星的组合物中的应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌在制备用于降解诺氟沙星的组合物中的应用。


背景技术：

2.诺氟沙星（norfloxacin），也称为氟哌酸，其化学名被称为1-乙基-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸。诺氟沙星属于第三代氟喹诺酮类药物，具有较强的广谱抗菌性、不易溶于水、能吸附土壤矿物质以及易被环境生物吸收等特点，成为广泛使用的抗生素之一。诺氟沙星投放于对虾养殖池塘后，水体药物浓度降低，而底泥吸附残留严重；诺氟沙星等抗生素随着养殖时间增加而表现出累积现象；在自然环境中残留的诺氟沙星等氟喹诺酮类抗生素很难通过自身转化和自我降解，因此会表现一定的生态毒性。
3.抗生素被动物吸收的部分仅有不到10%的药物经过新陈代谢，其余通过动物的尿液或粪便再次进入水体。喹诺酮类抗生素不易溶水,能与二价和三价的金属离子形成稳定的化合物，因此用在水产养殖的诺氟沙星药物会沉积在底泥中或者部分溶解在水体中，对生态产生广泛而深远的影响。此外，水体和沉积物中的微生物具有重要的营养和代谢功能，过量的诺氟沙星不仅会杀死环境中的许多菌群，引起生态失调，从而影响鱼类和人体健康，而且还会导致环境中菌群形成耐药性，从而威胁自然生态的平衡和人类的安全。
4.用于防控鱼病害的“渔药”通常通过添加抗生素以降低鱼病害发病率和死亡率。抗生素长期过量使用可能引起耐药性问题，从而使得原有的抗生素不能发挥其应有的效果，并可能影响动物或者人体健康。研究表明细菌可通过表达其耐药基因来实现其耐受作用，并且不同的耐药基因表现出不同的耐药机制。因此，养殖业亟需一种应对水体诺氟沙星富集的解决方案。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是，如何利用生物手段降解诺氟沙星。
6.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：本发明提供了解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens在制备用于降解诺氟沙星的组合物中的应用。
7.本发明提供了一种用于降解诺氟沙星的组合物，其特征是含有解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens。所述组合物还可选地含有缓释剂、营养素、电解质、多孔吸附材料、凝胶等生物菌剂制备领域常用助剂中的一种或多种，还可选地含有其它对降解诺氟沙星有效的微生物和/或酶。所述可选的组分应为根据本领域公知常识已知其效果的组分，本领域技术人员可根据实际需要自行调整。
8.优选的，所述解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens的获得包括以下步骤：s1.从需要降解诺氟沙星的养殖用水体和/或底泥原位采集水体样品和底泥样品；
s2.将采集到的底泥和/或水体样品制成菌悬液，将菌悬液加入诺氟沙星富集培养基中培养；s3.挑选菌落数为1-300的培养基，平板划线纯化得到一种或多种解淀粉芽孢杆菌；s4.选定一个或多个具有优异诺氟沙星降解性能的解淀粉芽孢杆菌菌株。所述选定一个或多个具有优异诺氟沙星降解性能的解淀粉芽孢杆菌菌株的方法为：取所述降解菌悬液接在不同降解体系中进行降解试验，测定其诺氟沙星降解率；所述具有优异有诺氟沙星降解性能的菌种，是指其在至少一个降解体系中的降解率为20-100%。
9.本发明具有如下有益效果：本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens在降解诺氟沙星中应用，可用于直接投入使用环境或制备用于降解诺氟沙星的组合物，有利于降低诺氟沙星在环境中富集并影响环境生态的风险。其在常见的养殖塘中繁殖良好，可以保证优异的诺氟沙星降解性能。
10.本发明提供一种含有解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens的、用于降解诺氟沙星的组合物，其可选地含有缓释剂、营养素、电解质、多孔吸附材料、凝胶等菌剂制备领域常用助剂，还可选地含有其它对诺氟沙星降解有效的微生物和/或酶，可以配合解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens的诺氟沙星降解能力，应用于不同场合。
11.本发明还提供了一种优选的解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens应用方法。由于所述解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens提取于原位生态环境，并按照原位生态环境的特点进行筛选和富集，其在应用过程中可能出现的其他技术问题更少，更加便于生态系统中的诺氟沙星降解。
12.本发明公开的解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens广泛分布于自然界，易于培养。其还具有较强的环境适应力，可以适用于常见养殖渔场，特别适用于四大家鱼的养殖。
13.本发明利用生物方法降解化学农药，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工，对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高水环境质量安全具有重要的意义。可以预见的，本发明所述的解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens可以应用在制备用于降解诺氟沙星的组合物。
附图说明
14.图1 解淀粉芽孢杆菌耐药菌降解诺氟沙星的浓度范围；图2 解淀粉芽孢杆菌的形态；图3 解淀粉芽孢杆菌菌株系统进化树；图4 环境ph值对解淀粉芽孢杆菌降解率的影响测试结果；图5 环境盐度对解淀粉芽孢杆菌降解率的影响测试结果。
具体实施方式
15.下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域
常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
16.实施例 1：诺氟沙星耐药菌的分离、纯化底泥和水体样品采自于某四大家鱼混养塘。
17.底泥样品的处理：称取10.0g底泥样品与90ml无菌水混合后，震荡。从中吸取10ml浑悬液与90ml富集培养基混合，震荡。再次吸取10ml浑悬液与90ml富集培养基混合，震荡，即为初始的底泥菌悬液。
18.表层水样品的处理：量取水样100ml，用真空泵和0.22μm的滤膜对表层水样品抽滤。将滤膜放入100ml富集培养基混合震荡，即为初始的表层水菌悬液。
19.所述富集培养基为加入了诺氟沙星的基础培养基。
20.基础培养基：每1l基础培养基含0.0023 g fecl3
·
6h2o, 0.025 g cacl2·
6h2o, 1.6 g kh2po4, 0.2 g mgso4
·
7h2o, 0.4 g k2hpo4, 0.5 g nh4no3, 和 0.2 g酵母提取粉。
21.分别取5 ml底泥菌悬液和表层水菌悬液加入到95ml富集培养基中，富集培养基中诺氟沙星浓度分别为0、10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、500 μg/ml。30 ℃、150 r/min摇床培养24 h。
22.将菌液依次稀释10倍、100倍、1000倍。分别取三个稀释度的菌悬液均匀涂布在对应诺氟沙星浓度的固体平板上，每个稀释度设置3个平行，30 ℃倒置培养1-3 d。观察并计数各平板的菌落数。从诺氟沙星高浓度平板上挑取单菌落，进一步平板划线纯化，直至长出形态一致的单菌落。根据菌落的形态对耐药菌进行分类、编号。观察菌落形态及用革兰氏染色法观察其个体形态。经过富集驯化培养和稀释平板培养的诺氟沙星耐药菌生长情况见表1。 可见平板中耐药菌数量随着诺氟沙星浓度增加而递减。在低诺氟沙星浓度时有大量的耐药菌，当诺氟沙星浓度≥200 μg/ml时，无耐药菌生长。
23.表1、实施例 2：诺氟沙星耐药菌的降解筛选和性能验证挑取纯化的耐药菌，分别接种至含不同浓度诺氟沙星的液体无机盐培养基中，30 ℃、150 r/min摇床培养24h。设不接菌只加入诺氟沙星的液体无机盐培养基为空白对照。降解组和对照组均用0.22μm滤膜过滤，去除大分子颗粒物质及菌体。然后各取1ml滤液用流动相定容 2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的诺氟沙星标准品溶液，测定并记录其峰面积，使用microsoft office excel软件绘制峰面积-诺氟沙星浓度曲线，作出线性回归方程。根据峰面积计算降解率。
24.降解率=(a0－as)
÷
a0
×
100%
式中:a0——作空白对照的液体无机盐培养基中诺氟沙星的峰面积；as——菌液中诺氟沙星的峰面积。
25.hplc工作条件：检测器为荧光检测器；流动相为磷酸:乙腈（82:18）；固定相为c18柱(4.6 mm
×
250 mm,5μm）；柱温45 ℃；波长450 nm；流速0.8 ml/min；进样量15μl。
26.将降解率最高的1株降解菌标记为norxu-2，进一步对该菌在加有诺氟沙星的无机盐培养基进行摇瓶降解试验，在诺氟沙星的浓度范围100-500μg/ml之间设置5个检测点，用滤膜过滤收集上清液样品，测定该菌株的降解率，结果见图1。
27.实施例 3：诺氟沙星降解菌的菌种鉴定对诺氟沙星降解效果较好的菌株 norxu-2进行革兰氏染色观察。形态特征见图2，可见，norxu-2在培养基上的菌落较扁平、边缘不整齐、呈乳白色不透明、较干燥。经显微观察发现其为革兰氏阳性菌，菌体呈长杆状、经孔雀绿染色可见芽孢。
28.将norxu-2菌株dna用细菌通用引物27f和1492r进行扩增并送华大基因公司进行测序。通过bioedit软件登陆ncbi的genbank核酸数据库，提交测得的序列进行blast在线比对。应用clustal w和mega 软件构建系统进化树，结果见图3。
29.经形态鉴定和分子鉴定，norxu-2菌株为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）。
30.实施例 4：自然环境下诺氟沙星降解菌的耐受性验证4.1 ph耐受范围测试采用诺氟沙星浓度为200μg/ml的降解体系，norxu-2降解菌在ph值4-9间的降解率见图4，可见其在ph=4-6的环境中均具有较好的降解性能，其中在ph=6时效果最好，降解率达53.64%。正常淡水养殖水体的ph值为6-9，该株菌在ph6时表现出高降解率，这与其分离自淡水养殖场底泥的原生境条件相符，可适用于大部分养殖环境。
31.4.2耐盐性验证海水中nacl含量约为3.5%，在诺氟沙星初始浓度为200μg/ml、ph=6的降解体系中设置nacl浓度0-4wt%。结果见图5，norxu-2在nacl%低于2.50%时的降解能力较稳定，当nacl浓度高于3%时降解率虽稍有下降，但总体降解效果稳定，提示其耐受高渗能力较好,可适用于淡水和海水养殖环境。
32.实施例 5：解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens的诺氟沙星降解性验证使用山东绿陇生物科技有限公司生产的解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens制备菌悬液，富集培养、降解率测试方法与实施例1-2所述方法相同，得到一株在ph=7、nacl浓度为0时，降解率为43.21%的菌株。提示解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens降解诺氟沙星的用途具有复现性。
33.本领域技术人员应当理解，以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应包括在本发明权利要求的保护范围之内。