一种复合酶及降解四环素的应用

1.本发明属于生物技术领域，更具体的，涉及一种复合酶及降解四环素的应用。


背景技术：

2.抗生素被广泛用于临床治疗和预防细菌感染，并在畜牧业中大量应用以促进生长。抗生素的大量使用，导致抗生素耐药性细菌迅速出现，这正在成为威胁公众健康的问题。在抗生素的主要种类中，tcs一直是对抗具有悠久历史的细菌的主要抗菌剂。tcs积极靶向广谱微生物病原体，包括细菌，螺旋体，支原体和原生动物寄生虫。这一特点与其高成本效益相结合，tcs已广泛应用于农业，特别是畜牧业，家禽和水产养殖业。
3.过度生产和消费的tc越来越被意识到生态环境中作为潜在污染物的持续存在，众所周知，由于tc在宿主体内的吸收和不良代谢，因此以活性形式代谢，并且大多数以未修饰的方式排泄到环境中。此外，制药废水的处理和净化不足导致大量tc残留物排放到环境中。tcs的延长暴露通常通过增加选择压力来刺激环境微生物组和肠道共生中抗生素耐药性的上升，对生物体健康造成严重威胁。
4.为了解决tc在环境中的残留问题，目前已经建立了多种技术来从其原型中去除或另tc失活。常见的tc降解技术通常涉及化学或物理方法，如fenton氧化，光催化，电化学氧化，臭氧化，絮凝和吸附，另外，现发现包括细菌和真菌在内的各种微生物能够在一定条件下降解tc，不仅活微生物，微生物酶也被纯化用于在以前的工作中去除tc。然而，现有方法有利有弊，如何开发能够提高效率，降低成本和易于操作的新方法仍然是创新和努力的方向。
5.因此，急需建立一种可行的方法有效降解环境中残留的四环素。现有存在一种编码单加氧酶的新型tet(x)基因，该基因赋予广谱tc抗生素高水平的失活。在接下来的工作中，开发了相应的tet(x)酶作为基于酵母表达平台去除tc残基的有用工具。然而，tet(x)仅催化tc的区域选择性羟基化，tc的进一步降解高度依赖于随后的分子内环化和非酶分解。这一缺点限制了其在tc环境净化方面的进一步应用。


技术实现要素：

6.本发明基于现有技术存在的上述问题，提供了一种复合酶，利用单加氧酶tet(x4)和金属有机框架cu基mof协同组合降解环境中的四环素。
7.本发明的第二个目的是提供上述复合酶的制备方法。
8.本发明的第三个目的是提供上述复合酶在降解四环素类抗生素中的应用。
9.本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
10.一种复合酶，所述复合酶由单加氧酶tet(x4)和金属有机框架cu基mof结合得到。
11.本发明将能够高度灭活四环素类抗生素的tet(x4)与金属有机框架cu基mof结合了起来，构建了一个全新的协同组合降解体系tm。该mof中固定的tet(x4)可以在环境中感知tc，随后在tc催化区域选择性羟基化，产生h2o2作为一部分的未耦合反应，并与mof产生协
同作用反应产生
·
oh和
·
o2-等自由基，从而以一种高效的方式促进tc羟基化和络合tc的非酶分解。
12.本发明还提供所述的复合酶的制备方法，包括以下步骤：
13.s1、利用基因工程的方法得到含单加氧酶基因tet(x4)的工程菌，经过诱导、纯化后得到单加氧酶tet(x4)；
14.s2、将纯化后的tet(x4)和na2bdc用蒸馏水悬浮得到悬浮液，然后进行磁力搅拌；
15.s3、将cu(ch3coo)2加到s2的悬浮液中，搅拌后离心收集产物并重新分散即可。
16.本发明还提供所述复合酶在降解四环素类抗生素中的应用。
17.优选的，所述四环素类抗生素为盐酸四环素。
18.优选的，所述复合酶中，单加氧酶tet(x4)和金属有机框架cu基mof的用量比为2:1，所述盐酸四环素的浓度为50ppm。
19.高级氧化技术(apos)，通过一定的条件产生具有强氧化能力的羟基自由基，氧化分解大分子物质成低毒或无毒的小分子物质，在降解环境类抗生素等微量有害化学物方面存在巨大优势，已成为最流行的环境净化方法之一。本发明创新性开发一种tet(x4)与cu基mof相结合，协同响应高级氧化过程(apos)，以产生过氧化氢对tc进行羟基化，达到降解的效果。tet(x)酶和mof的组合产生的h2o2进一步与mof协同相互作用，通过芬顿样反应产生
·
oh和
·
o2-等自由基，以高效的方式促进tc羟基化和络合tc的非酶分解。该技术需要清楚了解tet(x4)作用机制，并表达高纯度的tet(x4)；二是通过一定的化学方法使cu基mof与tet(x4)稳定结合，保护酶的稳定性和可用性，确保反应的稳定进行。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.1、本发明中通过cu基mof固定tet(x4)的方式构建tm降解体系，mof的多孔结构和比表面积可以有效保护酶的稳定性和可用性，进而提高酶的活性。同时，在tc存在下通过级联催化反应快速生成
·
oh和
·o2-降解tc，具有明显的协同降解效果，并且远大于一次性使用tet(x4)和mof。
22.2、本发明操作简单，效率高，不需要高温高压、电、光辐射、声等反应条件，室温下即可发挥降解效果，反应要求较低。
23.3、本发明应用范围广，实用性强，在不同的环境介质(池塘水、牲畜污水、尿液、制药废水)均能充分发挥作用，具有良好的降解效果。
附图说明
24.图1为tet(x4)产双氧水的表征图；
25.图2是不同体系对盐酸四环素的降解效果图；
26.图3是tet(x)与mof的协同降解效率热图；
27.图4是tet(x)与mof对制药废水中四环素的降解效果图；
28.图5是基于hsa模型的三维协同指数模型图。
具体实施方式
29.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的
材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.一、降解酶tet(x4)产双氧水表征
31.实验过程如下：
32.(1)；挑取单菌pet28a-tet(x4)和pet28a-空载(空载组)至含50ug/ml卡那霉素的lb肉汤，置于37℃静置培养14h；
33.(2)吸取一定量步骤(1)培养好的菌液，以5500rpm，离心5min弃上清，加入等体积pbs缓冲溶液，涡旋混匀，再以5500rpm，离心5min弃上清，pbs缓冲溶液洗涤重复三遍；
34.(3)洗涤完毕，pbs缓冲溶液重悬，调整od
600
＝0.5；
35.(4)向步骤(3)细胞悬液添加盐酸四环素底物，终浓度为25μm，避光孵育30min；
36.(5)向步骤(4)孵育后的细胞悬液继续添加ros检测探针dcfh2-da，避光孵育30min；
37.(6)吸取一定量步骤(5)孵育后的细胞悬液，重复步骤(2)pbs缓冲溶液洗涤三次；
38.(7)吸取200ul步骤(6)细胞悬液加入96孔板各孔，每株菌各设置三个重复，测定荧光强度。
39.实验结果如图1，相对于空载组，tet(x4)能够产生大量的h2o2以氧化ros检测探针dcfh2-da生成荧光化合物，从而得到较高的荧光强度，证明发生了显著的活性氧水平升高。
40.二、tm的制备
41.1、单加氧酶的制备：
42.(1)扩增单加氧酶基因tet(x4)，使用takara公司的胶回收试剂盒回收电泳片段产物；
43.(2)将质粒pet28a通过酶切、电泳并回收片段产物；将步骤(1)中的最终pcr产物和质粒酶切后产物用无缝克隆重组，得到pet28a-tet(x4)质粒；
44.(3)将步骤(2)得到的pet28a-tet(x4)质粒转入大肠杆菌感受态细胞bl21(d3)中进行增殖培养，最终得到bl21-pet28a-tet(x4)工程菌；
45.(4)将工程菌bl21-pet28a-tet(x4)接种到含有50ug/ml卡那霉素的lb肉汤培养基并置于37℃以200rpm的速度进行增殖培养，直到od
600
＝0.6；
46.(5)将异丙基-β-d-硫代乳糖苷(iptg)加入步骤(4)中的悬浮液，终浓度为1mm，并置于16℃下以200rpm振荡孵育过夜；
47.(6)收集步骤(5)孵育后的悬浮液，使用等体积的pbs进行润洗，最后置于4℃，9000rpm离心5min收集细胞沉淀；
48.(7)使用低温超声破碎对步骤(6)得到的细胞沉淀进行裂解得到澄清裂解液；
49.(8)将步骤(7)得到的裂解液预平衡的histrap hp柱(ge healthcare，il，usa)进行后期纯化。用洗脱缓冲液(用500mm咪唑洗涤缓冲液)洗脱结合蛋白，并用bca蛋白测定定量，然后在4℃下透析20小时得到纯化后的tet(x4)。
50.2、tm的制备
51.(1)上述纯化后的tet(x4)和na2bdc使用10ml蒸馏水悬浮；
52.(2)将步骤(1)得到的悬浮液在磁力下以1000rpm搅拌均匀；
53.(3)将10ml cu(ch3coo)2(20.2mg/ml h2o溶液)加入步骤(2)的悬浮液中；
54.(4)搅拌1h后，通过离心收集产物并重新分散即得到cu基mof固定的tet(x4)，简称
为tm。
55.实施例1 tm降解四环素的协同效果
56.实验过程如下：
57.(1)配制终浓度为50ppm的盐酸四环素溶液；
58.(2)分别设置单独tet(x4)60μg/ml，单独mof 30μg/ml和tm 90μg/ml各三组，每组三个平行，迅速加入步骤(1)的溶液中，搅拌均匀；
59.(3)将步骤(2)不同的反应体系加入三氟乙酸淬灭反应，检测剩余盐酸四环素的浓度，180min后即完成整个反应。
60.实验结果如图2，从图2可知，反应体系反应60min内，与其他两组相比，tm降解四环素的速度显著提高，降解效率最高，降解性能最好，以上实验结果表明tm对降解四环素有很好的协同效果。
61.实施例2 tm对四环素的最大降解效果
62.实验过程如下：
63.(1)配制终浓度为50ppm的盐酸四环素溶液；
64.(2)设置不同浓度的tet(x4)和mof进行组合，每组三个平行，加入步骤(1)的溶液中，搅拌均匀；
65.(3)将步骤(2)不同的降解反应体系置于37℃进行避光处理；
66.(4)在降解体系反应1h后，收集水样加入三氟乙酸淬灭反应，检测剩余的盐酸四环素的浓度。
67.实验结果如图3，随着tet(x4)和mof浓度增加，tm降解四环素效率逐渐增加，最大可达到94.49％，远远超过了单一tet(x4)和mof的降解效率。
68.实施例3 tm对环境基质中四环素的降解效果
69.实验过程如下：
70.(1)收集一定量制药厂的排泄废水；
71.(2)将步骤(1)收集的制药废水设置空白对照组和处理组，每组三个平行，90μg/ml的tm迅速加入处理组中，搅拌均匀，空白对照组不作任何处理；
72.(3)将步骤(2)中不同组反应体系置于37℃避光处理；
73.(4)在降解体系反应1h后，收集水样加入三氟乙酸淬灭反应；
74.(5)将步骤(4)得到的水样进行前处理，检测剩余盐酸四环素的浓度。
75.前处理的操作为：取步骤(4)得到水样，置于4℃，15000rpm离心15min收集上清，加入等上清体积的na2edta-mdlvaine缓冲液，涡旋混匀；加入125μl正己烷和125μl氯仿，混合振荡混匀10min；超声振荡15min，最后置于4℃，15000rpm离心15min收集上清用于检测剩余盐酸四环素的浓度。
76.实验结果如图4，在制药废水中，存在高水平浓度的tc残留物，相对于空白对照组，处理组中的tm的添加大大降低了制药废水中的tc含量，近一半的tc(47.9％)被降解。
77.实施例4协同降解能力表征及建模量化水平评估
78.实验过程如下：
79.(1)配制终浓度为50ppm的盐酸四环素溶液；
80.(2)将各tet(x4)和mof浓度比为2：1的tm加入步骤(1)的溶液中，每组三个平行，搅
拌均匀；
81.(3)将步骤(2)不同的降解反应体系置于37℃进行避光处理；
82.(4)在降解体系反应1h后，收集水样加入三氟乙酸淬灭反应，检测剩余的盐酸四环素的浓度；
83.(5)利用步骤(4)浓度数据进行建模并量化协同参数。
84.实验结果如图5，红色区域表示协同效应，绿色区域表示相加效应，hsa值高达39.617，结果表明，tet(x4)和mof联合降解tc是协同效应，并且效果显著，随着tet(x4)和mof浓度的增加而增加。
85.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。