一种氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱的制备和使用方法与流程

本发明涉及一种发酵食品分析的前处理方法，具体为一种氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱的制备和使用方法。

背景技术：

氨基甲酸乙酯( EC) 又称为尿烷，是一种2A 类致癌性化学污染物，普遍存在于发酵食品和饮料酒中，属于发酵和储存过程中无法避免产生的副产物，因此需要对其进行严格的监管。食品中的EC一般采用光度法、气相\气质、液相\液质进行分析，但EC的含量一般很低（ppm级），且样品背景复杂，不能直接进样或达不到较好的分析效果，常常需要对样品进行富集和纯化处理。对EC的前处理主要是采用旋转蒸发、液液萃取和固相萃取，而固相萃取（Solid-Phase Extraction，简称SPE）是近年发展起来一种新型样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，与传统的旋转蒸发和液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率，更有效的将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力、易实现自动化操作，而固相萃取中的填料是得到良好萃取效果的关键。目前，对EC的萃取柱主要有C18柱、氨基固相柱、N-丙基乙二胺( PSA)柱等等，但往往都有收率和重现性不高，以及净化效果不理想等问题。分子印迹聚合物（MIP）是通过分子印迹技术合成的对特定目标分子（模板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物。

技术实现要素：

本发明正是针对以上技术问题，提供一种氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱的制备方法。该方法以EC为模板分子，采用本体聚合法合成了EC-MIP，以EC-MIP为萃取柱的填料，用于发酵食品中EC分析的样品前处理，解决以往在对EC固相萃取时，净化效果不好、收率低和稳定性差的问题。

本发明的另外一个发明目的是提供以上所述氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱的使用方法。

本发明的具体技术方案如下：

一种氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱的制备方法，该方法包括EC分子印迹聚合物的制备方法，萃取柱的制备以及吸附后的洗脱方法。

1）EC分子印迹聚合物的制备方法

称取少量EC和丙烯酰胺作为模板分子和功能单体，溶于致孔剂氯仿中，置于振荡器中振荡约半个小时，使模板分子与功能单体充分作用；然后加入一定量的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，充分混溶后超声1刻钟，然后通氮气约15min；将密封好的锥形瓶放入58~60℃恒温水浴锅中聚合一天，得到分子印迹聚合物；

将获得的聚合物采用研钵磨碎，经100~120目筛子筛分；用滤纸包裹聚合物置于索氏提取器中，甲醇/冰乙酸溶液作为萃取溶剂，调节加热套至55-65℃，保持萃取器中每30min产生一次虹吸现象，连续萃取至聚合物中无模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制温度60℃干燥，即得到所需聚合物EC-MIPs；

2）萃取柱的制备方法

在一只小针筒注射器或类似容器中底部平铺一层玻璃棉，称取一定量的MC-MIPs于小柱中，轻轻敲打使其紧实，然后在聚合物上方平铺1层玻璃棉，即得 EC印迹分子萃取柱MISPE。

氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱吸附后的洗脱方法，包括以下步骤：

MISPE柱装好后，依次用甲醇，乙腈通过小柱，去除MIPs中存在的杂质，并使其溶剂化，2~4mL/min作为上样流速，甲醇/水/冰乙酸按V/V/V =8:1:1作为洗脱液，洗脱液体积为6.0~20mL，收集洗脱液即实现对EC富集和纯化。

所述EC分子印迹聚合物的制备方法具体包括以下步骤：

准确称取0.0751gEC（模板分子，1mmoL）、0.2843g丙烯酰胺（功能单体，4.0mmoL）溶于10mL氯仿（致孔剂）中，置于振荡器中振荡30min，使模板分子与功能单体充分作用。然后加入乙二醇二甲基丙烯酸酯3.9643g（交联剂，20mmoL）、40.0mg偶氮二异丁腈（引发剂），充分混溶后超声15min，然后通氮气15min。将密封好的锥形瓶放入58℃恒温水浴锅中聚合24h，得到分子印迹聚合物。将获得的聚合物采用研钵磨碎，经120目筛子筛分。用滤纸包裹聚合物置于索氏提取器中，以9：1（V：V）甲醇/冰乙酸溶液作为萃取溶剂，调节加热套适宜温度，保持萃取器中每30min产生一次虹吸现象，连续萃取48h，并在过程中更换3次萃取液，确保洗至无模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制温度60℃干燥15h，即得到所需聚合物（EC-MIPs）。

所述萃取柱的制备方法，在一只2mL针筒注射器或类似容器中底部平铺一层玻璃棉，准确称取100.0mgMC-MIPs于小柱中，轻轻敲打使其紧实，然后在聚合物上方平铺1层玻璃棉，即得 EC印迹分子萃取柱（MISPE）。

所述吸附后的洗脱方法为：MISPE柱装好后，依次用5mL甲醇，5mL乙腈通过小柱，去除MIPs中可能存在的杂质，并使其溶剂化，2mL/min作为上样流速，以甲醇/水/冰乙酸（8:1:1，V/V/V）作为洗脱液，洗脱液体积为6.0mL，收集洗脱液即实现对EC富集和纯化的目的。

一种基于EC的固相萃取柱的使用方法，即利用分子印迹聚合物的高选择性实现对样品中EC的富集和纯化处理。EC分子印迹聚合物是利用EC分子为模板分子，通过添加功能单体、致孔剂、交联剂和引发剂，合成的一种高分子聚合物，将该聚合物中的模板分子采用合适的容积洗脱后，就得到了带有三维立体空隙的对EC分子具有特异性识别和选择性吸附的聚合物，在对样品中EC吸附后，通过洗脱剂将吸附上的EC洗脱下来，收集洗脱剂就实现了对复杂基质样品中EC的富集和纯化。

本发明的积极效果体现在：

（一）、用于发酵食品中EC分析的样品前处理，具有净化效果，收率高的特点。

（二）、在发酵食品中EC分析方法研究和EC分析标准建立与使用中具有较好的应用前景。

（三）、采用EC分子印迹聚合物作为固相萃取柱的填料，解决以往在对EC固相萃取时，净化效果不好、收率低和稳定性差的问题。

（四）、收率高。通过与C18和氨基固相柱对比实验，收率约高50%。MISPE柱重复使用6次后， EC回收率仍在85%左右。

（五）、将EC-MIPs分别吸附浓度为300mg/L的其它氨基甲酸酯类农药，如异丙威，速灭威，仲丁威。EC-MIPs对EC、异丙威、速灭威、仲丁威的吸附量分别为13.25mg/g，3.14 mg/g，4.15 mg/g，4.37 mg/g，EC-MIPs对EC的吸附量远远大于其他农药。

附图说明：

图1为EC-NIPs的扫描电镜图

图2为本发明中所述EC-MIPs的扫描电镜图

图3为EC-MIPs的空隙构象示意图

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。本领域技术人员可以对本专利作各种改动或修改，但这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

（1）采用0.0751gEC（模板分子，1mmoL）、0.2843g丙烯酰胺（功能单体，4.0mmoL）溶于10mL氯仿（致孔剂）中，置于振荡器中振荡30min，使模板分子与功能单体充分作用。

（2）加入乙二醇二甲基丙烯酸酯3.9643g（交联剂，20mmoL）、40.0mg偶氮二异丁腈（引发剂），充分混溶后超声15min，然后通氮气15min。将密封好的锥形瓶放入58℃恒温水浴锅中聚合24h，得到分子印迹聚合物。

（3）将聚合物采用研钵磨碎，经120目筛子筛分，用滤纸包裹聚合物置于索氏提取器中，9：1（V：V）甲醇/冰乙酸溶液作为萃取溶剂，调节加热套至60℃，保持萃取器中每30min产生一次虹吸现象，连续萃取48h，并在过程中更换3次萃取液，确保洗至无模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制温度60℃干燥15h，即得到所需聚合物（EC-MIPs）。

（4）在一只2mL针筒注射器中底部平铺一层玻璃棉，准确称取100.0mgMC-MIPs于小柱中，轻轻敲打使其紧实，然后在聚合物上方平铺1层玻璃棉。

（5）依次用5mL甲醇，5mL乙腈通过MISPE小柱，去除MIPs中可能存在的杂质，并使其溶剂化。2mL/min作为上样流速，甲醇/水/冰乙酸（8:1:1，V/V/V）作为洗脱液，洗脱液体积为6.0mL。

（6）收集洗脱液即得富集和净化的EC。

实施例2：

（1）采用0.751gEC（模板分子，10mmoL）、2.843g丙烯酰胺（功能单体，40mmoL）溶于10mL氯仿（致孔剂）中，置于振荡器中振荡30min，使模板分子与功能单体充分作用。

（2）加入乙二醇二甲基丙烯酸酯39.643g（交联剂，0.2moL）、0.4g偶氮二异丁腈（引发剂），充分混溶后超声15min，然后通氮气15min。将密封好的锥形瓶放入58℃恒温水浴锅中聚合24h，得到分子印迹聚合物。

（3）将聚合物采用研钵磨碎，经120目筛子筛分，用滤纸包裹聚合物置于索氏提取器中，9：1（V：V）甲醇/冰乙酸溶液作为萃取溶剂，调节加热套至58℃，保持萃取器中每30min产生一次虹吸现象，连续萃取48h，并在过程中更换3次萃取液，确保洗至无模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制温度60℃干燥15h，即得到所需聚合物（EC-MIPs）。

（4）在一只4mL针筒注射器中底部平铺一层玻璃棉，准确称取200.0mgMC-MIPs于小柱中，轻轻敲打使其紧实，然后在聚合物上方平铺1层玻璃棉。

（5）依次用10mL甲醇，10mL乙腈通过MISPE小柱，去除MIPs中可能存在的杂质，并使其溶剂化。2mL/min作为上样流速，甲醇/水/冰乙酸（8:1:1，V/V/V）作为洗脱液，洗脱液体积为12.0mL。

（6）收集洗脱液即得富集和净化的EC。

实施例3：

（1）采用3.755gEC（模板分子，50mmoL）、14.25g丙烯酰胺（功能单体，0.2moL）溶于10mL氯仿（致孔剂）中，置于振荡器中振荡30min，使模板分子与功能单体充分作用。

（2）加入乙二醇二甲基丙烯酸酯198.25g（交联剂，1moL）、2g偶氮二异丁腈（引发剂），充分混溶后超声15min，然后通氮气15min。将密封好的锥形瓶放入58℃恒温水浴锅中聚合24h，得到分子印迹聚合物。

（3）将聚合物采用研钵磨碎，经120目筛子筛分，用滤纸包裹聚合物置于索氏提取器中，9：1（V：V）甲醇/冰乙酸溶液作为萃取溶剂，调节加热套至60℃，保持萃取器中每30min产生一次虹吸现象，连续萃取48h，并在过程中更换3次萃取液，确保洗至无模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制温度60℃干燥15h，即得到所需聚合物（EC-MIPs）。

（4）在一只10mL针筒注射器中底部平铺一层玻璃棉，准确称取400.0mgMC-MIPs于小柱中，轻轻敲打使其紧实，然后在聚合物上方平铺1层玻璃棉。

（5）依次用20mL甲醇，20mL乙腈通过MISPE小柱，去除MIPs中可能存在的杂质，并使其溶剂化。2mL/min作为上样流速，甲醇/水/冰乙酸（8:1:1，V/V/V）作为洗脱液，洗脱液体积为24.0mL。

（6）收集洗脱液即得富集和净化的EC。

本申请并不局限于前述的具体实施方式。本申请扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。