一种混合离子交换模式的亲水色谱填料、其制备方法及应用与流程

本发明涉及色谱分离分析领域，具体地说，涉及一种混合离子交换模式的亲水色谱填料及其制备方法。

背景技术：

色谱填料及固定相作为色谱分离技术的核心，其发展直接影响着色谱分离的选择性和分离效率，制约着亲水作用色谱的应用和推广[chestert.l.etal,anal.chem.2013,85,579-589]。硅胶以良好的机械强度、可控的多孔结构、较好的化学稳定性等优点被广泛用于高效液相色谱固定相应用[qiuh.d.etal,anal.bioanal.chem.2011,399,3307-3322]。不同表面基团的键合硅胶可以应用于多种不同的色谱分离模式。其中在硅胶表面修饰上两性离子基团，可以制备性能优越的亲水色谱固定相。

典型的两性离子色谱材料，如硫代甜菜碱型(zic-hilic)和磷酸胆碱型(zic-chilic)，具有很高的亲水性和独特的分离选择性，被广泛用于分离小分子极性化合物、代谢产物、硫代葡萄糖苷、氨基糖苷、肽、糖肽和其他化合物[palmas.d.etal,anal.chem.2011,83,3440-3447]。但这种传统的两性离子色谱材料的表面正负电荷垂直于固定相表面分布，因而不能进行表面电荷的调控与优化。近期发展的新型两性离子材料，如半胱氨酸键合硅胶亲水色谱固定相，可形成带正负不同电荷基团平行于硅胶表面的结构类型，使所制备的分离材料不仅具备较好的亲水性，同时具有电荷调控能力[shena.j.etal,chem.commun2011,47,4550-4552]。这种新型的两性离子色谱材料也是目前该体系材料发展的热点与趋势。

而纵观两性离子功能相的设计，含“巯基”的氨基酸、小肽样品较少。因此，基于以上的研究背景，本发明采用相反的“巯基-烯烃”合成策略，将“巯基”修饰到硅胶表面，在两性离子功能相上修饰上“烯基”，这样在两性离子功能相的设计中还可以很好地引入不同带电能力官能团，设计出系列混合模式的两性离子功能相。同时，“巯基-烯烃”反应是是一种简单、快速、高效的小单元拼接反应，反应过程更为安全，且无重金属离子催化，更为绿色环保[hoylec.e.etal,chem.soc.rev.2010,39,1355-1387]。因此，该反应过程可广泛应用于材料的制备。这类新型混合离子交换模式的亲水色谱填料的成功制备将为丰富两性离子分离材料提供了可观的保障，也为材料应用研究提供更多的发展思路和方向。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题是，提供一种新型的混合离子交换模式的亲水色谱填料。本发明要解决的另一个技术问题是，提供该色谱填料的制备方法。本发明要解决的另一个技术问题，是提供该色谱填料的应用。

本发明的技术方案是，一种混合离子交换模式的亲水色谱填料，以硅胶为基质，键合相末端为两性离子官能团，其化学结构式为：

其中silicagel为球型硅胶，是末端带烯基的两性离子键合相，n＝0～4，x是带正电荷的官能基团，选自氨基，季铵基中的一种，y是带负电荷的官能基团，选自羧基，磺酸基中的一种。

优选的是，球型硅胶的粒径1～20μm，孔径

本发明还提供了上述的混合离子交换模式的亲水色谱填料的制备方法，其具体步骤为：

(1)两性离子键合相的合成

以烯丙基胺、溴乙酸乙酯、丙磺酸内酯、boc-甘氨酸、甜菜碱中的三种为原料，采用逐步反应法将不同电荷强度的带电荷官能基团反应，生成带“强”“弱”不同离子交换能力的两性离子键合相，且保证该两性离子键合相末端带有“烯基”基团；

所述的两性离子键合相为“带正电荷的氨基”与“带负电荷的羧基”的弱阴/弱阳离子交换功能相(wax/wcx)，“带正电荷的氨基”与“带负电荷的磺酸基”的弱阴/强阳离子交换功能相(wax/scx)，“带正电荷的季胺基”与“带负电荷的羧基”的强阴/弱阳离子交换功能相(sax/wcx)与“带正电荷的季胺基”与“带负电荷的磺酸基”的强阴/强阳离子交换功能相(sax/scx)这四种混合模式的两性离子功能相中的一种；

(2)硅胶预处理

将每克球型硅胶加入2～100ml质量浓度为1～40％的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌1～48小时，过滤，水洗至中性，于100～160℃下干燥至恒重，得到活化硅胶；

(3)硅胶表面修饰

将步骤(2)所得的活化硅胶置于反应容器中，在氮气氛围下加入有机溶剂，搅拌均匀，滴加硅烷试剂，每克活化硅胶使用0.5～5mmol硅烷试剂；保持温度为20～200℃条件下搅拌2～48小时；待反应体系冷却至室温，减压过滤并依次用甲苯、丙酮、甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在60～100℃条件下干燥12～36小时，得到硅胶表面修饰的产品；

(4)巯基-烯烃点击反应

将步骤(3)所得硅胶表面修饰的产品置于反应容器中，在氮气氛围下加入有机溶剂，每克活化硅胶使用2～100ml有机溶剂搅拌均匀，加入两性离子键合相，搅拌均匀，再加入引发剂，引发剂的使用量为每克烯基或巯基硅胶使用0.01～1mmol；保持温度为20～200℃条件下搅拌2～48小时；待反应体系冷却至室温，减压过滤并依次用甲苯、丙酮、甲醇、水、甲醇洗涤，所得固体产品在60～100℃条件下干燥12～36小时，得到混合离子交换模式的亲水色谱填料。

理论上这样的设计使得键合相中带“正”和带“负”电荷的官能团是相当的。与传统的两性离子键合不同的是，新设计的“正”“负”电荷官能团是平行于硅胶基质两端，它会随不同ph的变化表现出差异化的带电情况，那么应用于离子化合物的分离分析就有更大的前景。

优选的是，所述反应容器，是玻璃或者聚四氟乙烯反应容器。

根据本发明的混合离子交换模式的亲水色谱填料的制备方法，优选的是，在所述的步骤(1)中，制备两性离子键合相“wax/wcx”的原料为烯丙基胺、溴乙酸乙酯和boc-甘氨酸，投料摩尔比为0.6-6:0.5-5:0.5-5；制备两性离子键合相“wax/scx”的原料为烯丙基胺、丙磺酸内酯和boc-甘氨酸，投料摩尔比为1.5-10:0.5-5:0.5-5；制备两性离子键合相“sax/wcx”的原料为烯丙基胺、溴乙酸乙酯和甜菜碱，投料摩尔比为0.6-6:0.5-5:0.5-6；制备两性离子键合相“sax/scx”的原料为烯丙基胺、丙磺酸内酯和甜菜碱，投料摩尔比为1.5-10:0.5-5:1-10。

因为一种两性离子键合相均有阳离子交换基团和阴离子交换基团，所以叫混合离子交换模式键合相修饰材料，而每次采用的是一种混合。

优选的是，在所述的步骤(3)中，所述的有机溶剂包括苯系物和烷烃中的一种。所用的有机溶剂为与水不互溶的有机溶剂，有机溶剂包括甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、正庚烷、正戊烷、正辛烷、环己烷中的一种；有机溶剂的使用量为每克活化硅胶使用2～100ml有机溶剂。

优选的是，在所述的步骤(3)中，硅烷试剂结构式为：

其中，x为-och3，-och2ch3或-cl,n＝0～4，a为巯基。

根据本发明的混合离子交换模式的亲水色谱填料的制备方法，优选的是，在所述的步骤(4)中，所述的两性离子键合相的使用量为每克烯基或巯基硅胶使用0.01～100mmol。

根据本发明的混合离子交换模式的亲水色谱填料的制备方法，优选的是，在所述的步骤(4)中，所述的引发剂为偶氮类引发剂，包括偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁脒盐酸盐中的一种。

根据本发明的混合离子交换模式的亲水色谱填料的制备方法，优选的是，步骤(4)引发剂的使用量为每克烯基或巯基硅胶使用0.2～1mmol。

本发明还提供了上述混合离子交换模式的亲水色谱填料在基于亲水作用色谱或离子作用色谱模式的极性样品分离，及修饰蛋白质组学中糖肽或磷酸化肽的选择性富集方面的应用。

本发明的有益效果是：

1.鉴于该混合离子交换模式的亲水色谱分离材料同时具有亲水性和电荷可调控性，可以简单地在一种材料中实现多种分离模式的联用，避免了分离富集操作的繁琐及复杂化；

2.硅胶的修饰引入新型的两性离子功能相，所设计的新型混合离子交换模式色谱填料的正负电荷中心平行于固体基质表面，表面正负电荷可以通过改变ph值进行调控和优化；

3.两性离子功能相进一步引入“强”“弱”阴/阳离子交换基团，进一步实现了一种材料具有混合的离子交换能力，可通过分离富集能力的差异及比较，明确离子交换特性，从而有效实现离子交换容量的控制与优化；

4.基于材料独特的性能，有望实现基于亲水作用色谱或离子作用色谱模式的极性样品分离及修饰蛋白质组学中糖肽或磷酸化肽的选择性富集，从而提供一种选择性更高、吸附量更大、可控性更好的分离富集新方法与新思路。

附图说明

图1为使用实施例1中的两性离子键合相的反应过程图；

图2为使用实施例1中的色谱填料的制备过程图；

图3为使用实施例2中的两性离子键合相的反应过程图；

图4为使用实施例3中的两性离子键合相的反应过程图；

图5为使用实施例4中的两性离子键合相的反应过程图；

图6为使用实施例2中的色谱填料在不同ph条件的磷酸二氢钾缓冲液中的ζ-电势图；

图7为使用实施例3中的色谱填料在不同ph条件的磷酸二氢钾缓冲液中的ζ-电势图；

图8为使用实施例4中的色谱填料在不同ph条件的磷酸二氢钾缓冲液中的ζ-电势图；

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

取250ml三口烧瓶，加入2.2g烯丙基胺，50ml四氢呋喃和12.5g三乙胺，置于冰浴中搅拌混合均匀，并通入氩气保护，再通过常压漏斗向反应体系中滴加入2.6g溴乙酸乙酯和17ml四氢呋喃的混合液30min以上，搅拌反应1小时，然后撤出冰浴，常温搅拌1.5小时。反应结束后将反应混合物旋蒸去除四氢呋喃，之后向残留物中加入37ml乙醚，搅拌萃取，加入少量无水硫酸钠干燥，抽滤分离得到液体，旋蒸得到黄色油状液体；取50ml圆底烧瓶，加入用8ml二氯甲烷溶解的1.75gboc-甘氨酸溶液，置于冰水浴中，搅拌均匀，滴加用4ml二氯甲烷溶解的2.06gdcc溶液，出现白色浑浊，冰浴反应1小时，滴加用4ml二氯甲烷溶解的1.43g上述黄色油状溶液和0.0122gdmap，撤去冰浴，常温搅拌反应一夜，停止搅拌，抽滤，用少量二氯甲烷洗滤饼，将滤液转移至50ml茄型瓶中，旋蒸除去二氯甲烷，得到浅黄色油状液体；将2ml三氟乙酸与8ml二氯甲烷的混合溶液加入到上述浅黄色油状液体中，室温搅拌1小时，反应结束后，旋蒸除去二氯甲烷，将剩余物质加入适量乙酸乙酯中溶解，用5％碳酸钠溶液洗涤至ph为8～9，取油相旋蒸除去溶剂得白色固体，干燥；取50ml单口烧瓶，加入0.6g上述白色固体，0.8g氢氧化钠，10ml甲醇，常温下搅拌8小时，之后用盐酸中和至ph为7～8，得两性离子键合相“wax/wcx”，该反应过程如图1所示。

称取5g球型硅胶(粒径5μm，孔径比表面300m²/g)，置于250ml三颈烧瓶中，加入80ml浓度为2mol/l的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，用4^#砂芯漏斗进行抽滤，水洗至中性，抽干于80℃烘箱中干燥过夜，得活化硅胶。在通入干燥的氮气的条件下，往活化硅胶中加入50ml干燥的甲苯，搅拌均匀，然后滴加5.9mlγ-三乙氧基丙基巯基硅烷，110℃条件下加热回流24小时，反应结束用4^#砂芯漏斗进行抽滤，依次用甲苯、丙酮、水、甲醇清洗，抽干于80℃烘箱中干燥过夜，得巯基硅胶。在通入干燥的氮气的条件下，称取5g巯基硅胶，加入50ml无水甲醇，搅拌均匀，加入溶解于10ml甲醇的两性离子键合相“wax/wxc”0.5g，搅拌均匀，加入溶解于5ml无水甲醇的2,2-偶氮二异丁腈0.1g，搅拌均匀，升温至65℃，加热回流48小时，反应体系冷却至室温，4^#砂芯漏斗进行抽滤，依次用水、甲醇清洗，抽干于80℃烘箱中干燥过夜，最终得混合离子交换模式的亲水色谱填料ⅰ，制备过程如图2所示。

实施例2

取50ml的三口烧瓶，加入12.0g烯丙基胺，置于温度为45℃的油浴锅中，冷凝回流，缓慢滴加6ml丙磺酸内酯，加热搅拌反应2小时，得到黄色油状液体，反应结束后，用乙醚适量多次地洗涤混合物，直至有白色晶体析出；取50ml圆底烧瓶，加入用8ml二氯甲烷溶解的1.75gboc-甘氨酸溶液，置于冰水浴中，滴加用4ml二氯甲烷溶解的2.06gdcc溶液，出现白色浑浊，冰浴搅拌反应1小时，滴加用4mldmso溶解的1.79g白色晶体和0.0122gdmap，撤去冰浴，常温搅拌反应一夜，反应结束，抽滤，用少量二氯甲烷洗滤饼，将滤液转移至50ml茄型瓶中，旋蒸除去二氯甲烷，得到浅黄色油状液体；将2ml三氟乙酸与8ml二氯甲烷的混合溶液加入到浅黄色油状液体，室温搅拌1小时，反应结束后，旋蒸除去二氯甲烷，将剩余物质加入适量乙酸乙酯中溶解，用5％碳酸钠溶液洗涤至ph为8-9，取油相旋蒸，得两性离子键合相“wax/scx”，该反应过程如图3所示。

两性离子键合相“wax/scx”键合硅胶的操作同实施例1，最终得混合离子交换模式的亲水色谱填料ⅱ。

实施例3

取250ml三口烧瓶，加入2.2g烯丙基胺，50ml四氢呋喃和12.5g三乙胺，置于冰浴中搅拌混合均匀，并通入氩气保护，再通过常压漏斗向反应体系中滴加入2.6g溴乙酸乙酯和17ml四氢呋喃的混合液30min以上，搅拌反应1小时，然后撤出冰浴，常温搅拌1.5小时。反应结束后将反应混合物旋蒸去除四氢呋喃，之后向残留物中加入37ml乙醚，搅拌萃取，加入少量无水硫酸钠干燥，抽滤分离得到液体，旋蒸得到黄色油状液体；取100ml三口烧瓶，加入1g无水甜菜碱，5ml二氯亚砜，置于72℃油浴锅中，加热搅拌，冷凝回流2小时，滴加入5ml甲苯，搅拌5min，撤去油浴锅，冰浴中快速搅拌冷却，析出沉淀，分离除去液体，固体用5ml甲苯洗涤，洗涤三次，得到氯化甜菜碱酰氯固体；取0.7g黄色油状液体，溶解于10ml四氢呋喃中，缓慢滴加入冰浴的氯化甜菜碱酰氯中，滴加完毕后继续搅拌十分钟，分离得到固体，少量多次使用乙醚洗涤固体至乙醚洗液无色；取100ml单口烧瓶，加入0.6g上一步产物，0.8g氢氧化钾，10ml甲醇，常温下搅拌8小时，之后用盐酸中和，得到两性离子键合相“sax/wcx”，该反应过程如图4所示。

两性离子键合相“sax/wcx”键合硅胶的操作同实施例1，最终得混合离子交换模式的亲水色谱填料ⅲ。

实施例4

取50ml的三口烧瓶，加入12.0g的丙烯胺，置于温度为45℃的油浴锅中，在冷凝回流的条件下，缓慢滴加6ml的丙磺酸内酯，加热搅拌反应2.5小时。反应结束后，用乙醚适量多次地洗涤液态的反应混合物，吸去乙醚层，得到中间产物；取50ml的三口烧瓶，加入0.42g的干燥过的甜菜碱，置于温度为72℃的油浴锅中，在冷凝回流的条件下，滴入2ml的二氯亚砜，加热搅拌反应1.5小时。反应结束后，加入5ml甲苯，搅拌5min，后置于冰浴中搅拌冷却，析出晶体，吸去上层的甲苯洗液，固体产物继续用5ml甲苯洗涤，洗涤三次，吸去甲苯，得酰氯化甜菜碱；在的烧瓶中加入，超声，得到均匀分散的浊液。取50ml的锥形瓶，加入分散于3mldmf的酰氯化甜菜碱，将分散于10mldmf的中间产物1.25g浊液倒入恒压滴液漏斗，在冰浴的条件下，缓慢滴入1.5ml的三乙胺于烧瓶中，后控制恒压滴液漏斗的滴速，将浊液缓慢加入，之后补加3ml的dmf于滴液漏斗中洗下残留在壁上的小颗粒，全部滴加完成后，继续搅拌15min。停止反应，离心分离后得到固体产物，用乙醚适量多次地洗涤直至乙醚层接近无色，除去乙醚，得到两性离子键合相“sax/scx”，该反应过程如图5所示。

两性离子键合相“sax/scx”键合硅胶的操作同实施例1，最终得混合离子交换模式的亲水色谱填料ⅳ。

实施例5

测定实施例2中混合离子交换模式的亲水色谱填料ⅱ在不同ph值条件下的ζ-电势的变化趋势。具体方法为：称取50mg的实施例2中的材料，加入30ml的水超声分散。取1ml上述溶液加入2ml不同ph条件下的磷酸二氢钾缓冲液和7ml水，振荡均匀，转移至malvernzetasizernano-zs90测试仪测定材料表面的电势变化。实施例2中的材料ζ-电势随ph条件变化的趋势图如图6所示。

实施例6

测定实施例3中混合离子交换模式的亲水色谱填料ⅲ在不同ph值条件下的ζ-电势的变化趋势。具体方法为：称取50mg的实施例3中的材料，加入30ml的水超声分散。取1ml上述溶液加入2ml不同ph条件下的磷酸二氢钾缓冲液和7ml水，振荡均匀，转移至malvernzetasizernano-zs90测试仪测定材料表面的电势变化。实施例3中的材料ζ-电势随ph条件变化的趋势图如图7所示。

实施例7

测定实施例4中混合离子交换模式的亲水色谱填料ⅳ在不同ph值条件下的ζ-电势的变化趋势。具体方法为：称取50mg的实施例4中的材料，加入30ml的水超声分散。取1ml上述溶液加入2ml不同ph条件下的磷酸二氢钾缓冲液和7ml水，振荡均匀，转移至malvernzetasizernano-zs90测试仪测定材料表面的电势变化。实施例4中的材料ζ-电势随ph条件变化的趋势图如图8所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。